سیتوکینین سالیسیلیک اسید رشد گیاه دمای پایین

سیتوکینین سالیسیلیک اسید رشد گیاه دمای پایین – ایران ترجمه – Irantarjomeh

مقالات ترجمه شده آماده گروه کشاورزی

مقالات ترجمه شده آماده کل گروه های دانشگاهی

مقالات

چگونگی سفارش مقاله

الف – پرداخت وجه بحساب وب سایت ایران ترجمه(شماره حساب)ب- اطلاع جزئیات به ایمیل irantarjomeh@gmail.comشامل: مبلغ پرداختی – شماره فیش / ارجاع و تاریخ پرداخت – مقاله مورد نظر --مقالات آماده سفارش داده شده پس از تایید به ایمیل شما ارسال خواهند شد.

نقش سیتوکینین و سالیسیلیک اسید در رشد گیاه در دماهای پایین

چکیده

دمای پایین با جلوگیری از چرخه سلولی، رشد گیاهی را محدود می کند و فیتوهورمونها در این مورد نقش های مهمی را ایفا می کنند اما مکانیسم های مولکولی که به وسیله آنها فیتوهورمونها بر رشد در دمای پایین اثر می گذارند تا حد زیادی نامعلوم هستند. ما دریافته ایم که آرابیدوپسیس تالیانا (Arabidopsis thaliana) هنگام رشد در دماهای ۲۳، ۱۶، ۱۰، و ۴ درجه سانتیگراد   می تواند با مورفولوژی عادی توسعه یابد اما به دوره کشت طولانی نیاز دارد. ما از طریق غربال کردن گیاهان جهش یافته به سیتوکینین و سالیسیلیک اسید می رسیم. در دمای ۴ درجه سانتیگراد، هم گیاهان amp1 که مقدار زیادی سیتوکینین دارند و هم گیاهان وحشی فرآوری شده با سیتوکینین برون زاد با افزایش تعداد کل سلولها سرعتهای رشد نسبی بیشتری از نوع کنترلی نشان می دهند. علاوه براین، گیاهان انتقال ژنی NahG که مقدار سالیسیلیک اسید کمتری دارند از گیاهان وحشی همراه با سلولهای بزرگتر، سریعتر رشد می کنند. تجلی فاکتورهای نسخه برداری اتصال تکرار C (CBFها) که واسطه بین سازگاری سرد با تحریک بیان ژنهای مجبور به سرد شدن می باشند، در دمای ژنوتیپ های آزمایش شده، مشابه هستند. بنابراین تجلی / تظاهر CBF در گیاهان جهش یافته به افزایش رشد مشاهده شده وابستگی پیدا نمی کند. رشد اصلاح شده با تجلی / تظاهر بالا رفته ۱: ۳ CYCDبویژه در گیاهان NahG مطابقت دارد. در دمای ۴ درجه سانتیگراد،  نسخه برداری (مضاعف سازی) داخلی افزایش یافته مسئول ایجاد سلولهای بزرگتر در گیاهان NahG بود در حالیکه تقسیم سلولی افزایش یافته در گیاهان amp1 مشاهده گردید.

واژگان کلیدی: آرابیدوپسیس تالیانا، چرخه سلولی، دمای پایین، mp1α، NahG

مقدمه

گیاهان غالبا در معرض دمای پایین هستند که یکی از مهمترین فاکتورهای زیست محیطی است که تا حد زیادی بر رشد، توسعه، بقا، تولید محصول و توزیع گونه ها اثر می گذارند (لیونز۱۹۷۳، لویتا، ۱۹۸۰). عده ای از گیاهان می توانند در پاسخ به دماهای پایین، مقاومت به دست بیاورند که سازگاری سرد نامیده می شود (توماشوف ۱۹۹۹)، که شامل سازگاری با سرما و سازگاری با انجماد می باشد. دماهای سرد کردن (۰-۱۵ درجه سانتیگراد) و انجماد <0) درجه سانتیگراد( بسته به مقاومت گونه ها در برابر سرما می توانند سبب آسیب رساندن به گیاهان شوند و رشد گیاهان را کاهش دهند (شیندر و همکارانش ۱۹۹۵، پیرس۱۹۹۹).

عده ای از گیاهان دارای منشاء معتدل از جمله آرابیدوپسیس تالیانا در برابر سرما مقاوم هستند و می توانند در دماهای سرد تا رسیدن به بلوغ رشد کند. سازگاری با سرما، تجلی فاکتورهای      نسخه برداری اتصالی تکرار C (CBFها) را سبب می شوند که به نوبه خود، بعضی از ژنهای پایین رونده نظیر ژنهای COR (تنظیم شده با سرما)، KTN( ایجاد شده با سرما)، LTI (ایجاد شده در دمای پایین) و RD (مسئول خشک شدن) را فعال می کنند. (کورکلا و بورگ- فرانک ۱۹۹۲، گیلمور و همکارانش ۱۹۹۲، ۱۹۹۸، نوردین و همکارانش ۱۹۹۳، یاماگوچی و شینوزاکی ۱۹۹۴، ژو و همکارانش۲۰۰۷). گر چه گیاهان در دمای پایین در طی سازگاری سرد برای بقا مقاومت به دست می آورند، بعضی از خصوصیات کشاورزی مهم نظیر اندازه کل گیاه، ریخت زایی و نوزایشی در پاسخ به دمای پایین به ویژه بر حسب ساماندهی مولکولی نیاز به فهم بهتری دارند.

…

در این مقاله، از میان راهکارهای پویش گیاهان هم یافته و فرآوری با فیتوهورمونهای بیرونی تحت شرایط ثابت ۴ درجه سانتیگراد، دریافتیم که به علت مدت طولانی چرخه سلولی، که تا اندازه ای به وسیله موازنه بین سیتوکینین و سالیسیلیک اسید تنظیم می شود، از رشد گیاهی جلوگیری  می شود.

سیتوکینین سالیسیلیک اسید رشد گیاه دمای پایین

مواد و روشها

ماده گیاهی

تمام خطوط نوع وحشی و جهش یافته آرابیدوپسیس تالیانا (L.) هینه (Heynh) در بستر  کلمبیا- ۰ می باشند. خط NahG نوعا به وسیله اسکات اوکنس (راه حل محصول، پارک مثلث تحقیق، NC) انتقال، علامت دهی یا متابولیستم گیاهان جهش یافته با فیتوهورمونهای تعدیل شده (اوکسین، سیتوکینین، اتیلن، براسینواسترویید (brassinosteroid) یا ژیبرلین (pin1, pin2,  pin3, pin7, tir1-1, aux1-7, axr2; cre1, ahk2, ahk3, amp1, 35s: ckx1; ein3-1; det2-1, bril-5 gal-3) به وسیله ABRC فراهم گردید اما به طور خاص نشان داده نشد. برای رشد ضد عفونی شده، سطح تمام بذرها استریل گردید و بر روی محیط نیمه سخت موراشیک- اسکوگ (سیگما- آلدریج، USA) تهیه شده با ۱% (W/V) ساکارز پخش شدند. برای فرآوری سیتوکینی، زییتن (سیگما، Zo164، ۵% ایزومرسیس و ۹۳% ایزومرترانس، USA) به صورت صفحاتی بر روی محیط نیمه سخت موراشیک- اسکوگ یا غلظت ۰۱/۰، ۰۵/۰، ۱/۰ و     mM 5/0 افزوده شد. بذرها به مدت ۵ روز در دمای ۴ درجه سانتیگراد در تاریکی فرآوری شدند و سپس در داخل صفحات یا کوزه ها کاشته شدند و در داخل محفظه رشد (محفظه زیست محیطی علمی پرسیوال، USA) در دمای ۲۳ درجه سانتیگراد قرار داده شدند تا به مدت یک هفته و با دوره نوری روز طولانی (۱۶ ساعت نور: ۸ ساعت تاریکی) رشد کنند، سرعت روانی  بود، سپس به دمای مشخص شده انتقال داده شد مگر اینکه به گونه دیگری مشخص گردد. موقعیتهای گیاه در داخل محفظه ها ۱۰ بار در مراحل تغییر داده شد.

سیتوکینین سالیسیلیک اسید رشد گیاه دمای پایین

آنالیز وزن، اندازه سلول و میزان کلروفیل

 اندازه گیری های وزن خشک بر روی زیست توده تمام جوانه های بدون ریشه که در آون خشک شده بود، انجام گرفت. اندازه سلولی برای بشره (اپیدرمیس) دور از محور و میان برگ (مزوفیل) بر روی برگهای گلسانه کاملا گسترش یافته انجام شد. برگها شفاف شدند و بر روی یک میکروسکوپ ترکیبی (DMRE، لیکا، آلمان) قرار داده شدند و با یک دوربین ویدیویی دیجیتال (spot RT، دستگاه های تشخیص دهنده، استرلینگ هاتیس) متصل شده به یک نرم افزار اجرایی کامپیوتر از همان سازنده (SPOT4.6) تصویر برداری شدند. برای اندازه گیری مساحت برگ، نشاها با یک پویشگر (کامل سازی ۴۹۹۰، اپسون) پویش شد و مساحت کل برگ در هر نشاء با نرم افزار آنالیز تصویری (WinRHIZO، فیلیپین) به دست آمد. سرعت های نسبی رشد (RGRها) از شیب خط رگرسیونی در W در مقابل t در تمام دوره فاصله گذاری نمایی رشد پنج محصول تخمین زده شد. برای اندازه گیری میزان کلروفیل، برگها در نیتروژن مایع خرد شدند، با استون ۸۰% (v/v) استخراج شدند و کلروفیل از جذب در ۶۴۵ و nm663 به صورت  اندازه گیری شد و به وسیله وزن تازه نرمالیزه شد. اطلاعات میانگین حداقل از سه آزمایش مستقل محاسبه شد (۵۰-۳۰ گیاه در هر آزمایش)

آنالیز بیان / تجلی ژنی

حدود ۱۰ روز پیش، نشانه های نوع وحشی amp1، NahG (کوتیلرونها و دو برگ مریی) از صفحات در ۲۳ یا ۴ درجه سانتیگراد به دست آمدند. ما RNA کل را از نشانه ها با استفاده از واکنشگر جداسازی تریزول به صورت توصیف شده در آموزشهای تولید کنندگان (سیگما- آلدریچ، USA) استخراج کردیم. اولین cDNA از RNA فرآوری شده با DNase با نسخه برداری معکوس (تاکارا، دالیان، چین) و اولیگو (dT)₁₈  سنتز شد. فاز نمایی بسط (توسعه) از طریق    بهینه سازی تعداد چرخه های برای هر قالب (الگو) با استفاده از cDNA تعیین شد تا تشخیص حداکثر اختلاف در تعداد نسخه ها (رونوشت ها) امکان پذیر شود پایه (آستر) زیر برای بسط نسخه مخصوص ژن طراحی شده اند.

سلولی سنجی جریان

نمونه هایی از ۴-۶ برگ کاملا گسترش یافته گیاه گلسانه که به مدت ۲۰ روز در دمای ۲۳ درجه سانتیگراد در کوزه رشد کردند و سپس به مدت ۵/۳ ماه در دمای ۴ درجه سانتیگراد به محفظه منتقل شدند، به دست آمد. برای آزاد کردن هسته، برگها با یک تیغ ریش تراش در ml 500 از خرد کننده سرد یخی (mM MgCl₂ 45، mM 30 سدیم سیترات، mM 20، ۳- ( N– مورفولینو) پروپان سولفونیک اسید Ph7 و ۱/۰% ترتیون ۱۰۰-x) خرد شدند (گالبرایت و همکارانش۱۹۹۱). ماده شناور بر روی مش mm 20  صاف شد (فیلتر شد) و هسته با  از ml 1 از ¢۴ و ۶- دی آمیدنیو ۲- فنیلیندول (DAPI) حاصل از محلول ذخیره mg ml^-1 1 لکه گذاری شد (رنگ شد) هسته با یک سلول سنج جریان ^TM (DB FACSAria ، سان جوز، USA) اندازه گیری شد و با نرم افزار تولید کننده آنالیز گردید.

سیتوکینین سالیسیلیک اسید رشد گیاه دمای پایین

نتایج

رشد طولانی مدت برای رسیدن به بلوغ در دمای پایین

دمای پایین از رشد گیاه جلوگیری می کند. آرابیدوپسیس در برابر سرما مقاوم است و معلوم شده که می تواند در دمای پایین تا بلوغ رشد کند اما این نکته معلوم نیست که رشد برای رسیدن به بلوغ در سرما تا چه اندازه فنوتیپ های مورفولوژی یا نوزایشی را تغییر می دهد. بنابراین، ما گیاهان را به مدت ۱۵ روز در دمای ۲۳ درجه سانتیگراد رشد می دهیم و آنها را به محفظه ها در دمای ۴، ۱۰، ۱۶ یا ۲۳ درجه سانتیگراد انتقال می دهیم تا کشت بذر کامل شود. در سرتاسر کار از دوره نوری با روز طولانی یکسانی استفاده شد. ما دریافتیم که همان گونه که انتظار می رود، رشد با دما به ویژه در ۴ درجه سانتیگراد به تدریج کاهش می یابد (شکل a1). گیاهان در تمام دماها تا رسیدن به بلوغ رشد کردند اما هنگامی که دما کاهش یافت، زمان گل دادن (شکوفه کردن) افزایش پیدا کرد و در دمای ۴ درجه از دمای ۲۳ درجه سانتیگراد تقریبا ۵ برابر طولانی تر شد (شکل C1). علاوه بر این، دما تقریبا هیچ اثری بر مورفولوژی یا اندازه نهایی گیاه نداشت (شکل d و b 1). از قرار معلوم، در حالیکه دمای پایین از سرعت رشد گیاه جلوگیری می کند، به نظر می رسد که فرایندهای توسعه ای اساسی را تغییر دهد.

اثر دمای پایین بر amp1

برای تشخیص فرایندهای مولکولی که پاسخ دمای پایین و فیتوهورمونها را به هم ارتباط می دهند، ۱۲ گیاه جهش یافته به فیتوهورمون را برای تغییر رشد در سرما بررسی کردیم. ما گیاهان را در صفحاتی به مدت ۱ هفته در دمای ۲۳درجه سانتیگراد رشد دادیم و سپس آنها را به مدت ۵۰ روز دیگر به دمای ۴ درجه سانتیگراد انتقال دادیم. در حالیکه تقریبا تمام گیاهان جهش یافته به طور قابل مقایسه یا ضعیف نسبت نوع وحشی رفتار کردند، amp1 استثنا بود. این گیاه جهش یافته در دمای۲۳ درجه سانتیگراد کمی سریعتر از نوع وحشی رشد کرد در حالیکه در دمای ۴ درجه سانتیگراد گرچه رشد در ۱۵ روز اول تقریبا به کندی نوع وحشی بود، سپس تسریع شد به طوریکه وزن جوانه های amp1 پس از ۵۰ روز در دمای ۴ درجه سانتیگراد تقریبا به وزن جوانه های گیاه رشد کرده در ۱۵ روز در دمای عادی رسید و این مدت زمانی بود که وزن نوع وحشی تقریبا نصف بود (شکل a2). این اختلافات با ارزیابی RGR ها برای توده وزن خشک جوانه ها در amp1 به طور قابل توجهی بالاتر بود در حالیکه amp1 در ۴۹ روز اول در دمای ۴ درجه سانتیگراد تقریبا دو برابر RCR نوع وحشی بود (شکل b2). اختلافات فنوتیپی amp1 و نوع وحشی پس از یک ماه در دمای ۴ درجه سانتیگراد در تمام ده آزمایش به طور پایدار مشاهده شد (شکل e2). 

سیتوکینین سالیسیلیک اسید رشد گیاه دمای پایین

اثر مقدار سالیسیلیک اسید بر رشد در دمای پایین

قبلا برای یک گیاه انتقال ژنی تغییر شکل یافته با یک ژن سالیسیلیک اسید هیدروکسیلاز باکتریایی، NahG، که محتوی مقادیر کاهش یافته ای از سالیسیلیک اسید می باشد، رشد افزایش یافته در دمای پایین گزارش شده است. این مطالب گزارش شد که رشد جوانه ها در این راستا از رشد جوانه در نوع وحشی در دمای ۴۳ درجه سانتیگراد غیر قابل تشخیص است اما در دمای ۵ درجه سانتیگراد به طول قابل توجهی سریعتر است و با سلولهای بزرگتر در برگهای گلسانه همراهی می شود (اسکات و همکارانش ۲۰۰۴). تحت شرایط آزمایشی ما، رشد گیاهان NahG نیز در دمای ۴ درجه سانتیگراد از رشد گیاهان نوع وحشی بهتر بود و با سلولهای بزرگتر همراه بود (شکلهای c2 و ۳). این نتایج نشان می دهد که کاهش مقدار سالیسیلیک اسید توانایی سلولها برای انبساط در سرما را افزایش می دهد.

آنالیز میزان بیان ژنهای سیکلین D  و CBF

گیاهان تحت فرآوری دمای پایین، مجموعه ای از ژنها را احتمالا برای سازگاری با سرما ایجاد     می کنند. مسیر بیان / تجلی ژنی مسئول سرما در آرابیدوپسیس به طول کاملا واضح روشن شده است (توماشوف ۲۰۰۱، کوک و همکارانش ۲۰۰۴). گروهی از فاکتورهای اصلی نسخه برداری (رونوشت) به نام CBF ها تعیین شده اند که به نظر می رسد در میان آنها مسئولی برای فعال سازی اغلب ژنهای شناخته شده، پایین رو و مسئول سرما وجود داشته باشد. (جالگو- اوتوسن و همکارانش ۱۹۹۸). این نکته جالب توجه است که سطوح (مقادیر) رونوشت CBF3,CBF2,CBF1 در نوع وحشی amp1 و NahG بر دمای پایین پاسخ مشابهی می دهند (شکل a4)، علاوه بر این، ما دریافتیم که مقادیر بیان ژنهای پایین روی مسئول سرما(,A (RD, COR, KIN2, RD2 هیچ اختلافی نداشتند (اطلاعات نشان داده نشده اند). از قرار معلوم، عملکرد اصلاح شده amp1 و NahG به تجلی / تظاهر تغییر یافته CBF بستگی ندارد. برای انجام آزمایش دیگری در مورد تجلی / تظاهر CBF در رشد گیاهان در دمای پایین، ما خطی را که CBF1 را کاملا تجلی می دهد در معرض دمای   ۴ درجه سانتیگراد قرار دادیم.

گیاهان NahG مقادیر مضاعف سازی داخلی (نسخه برداری داخلی) افزایش یافته ای را نشان می دهند.

رشد افزایش یافته گیاهان NahG تحت فرآوری دمای پایین به جای تقسیم سلولی افزایش یافته از انبساط افزایش یافته حاصل می شود (اسکات و همکارانش ۲۰۰۴). مضاعف سازی داخلی از نظر ماهیت گسترده است و چنین تصور می شود که به وسیله تنظیم کننده هایی مشابه با تنظیم کننده های کنترل کننده انتقال فاز G1/S در چرخه سلولی میتوتیک حاصل می شود. برای تعیین اینکه آیا اندازه سلول افزایش یافته NahG هسته را به وسیله سلول سنجی جریان آنالیز کردیم. پس از ۵/۳ ماه در دمای ۴ درجه سانتیگراد، برگهای گیاه نو وحشی یک الگو نوعی با مقادیر C (مقدار DNA هسته ) در محدوده ۲ C 16 نشان داد (شکل α۵). این الگو در amp1 مشابه بود (شکل b5). با این وجود، گیاهان NahG مضاعف سازی داخلی گسترده ای داشتند (شکل D و C5). گیاهان NahG در مقایسه با گیاهان نوع وحشی تقریبا یک چرخه داخلی اضافی داشتند که منجر به مقادیر DNA به بزرگی C32 گردید و به طور همزمان تعداد سلولهای C2 کاهش یافت. این نتایج با در نظر گرفتن همبستگی کاملا شناخته شد بین اندازه سلول و تعداد کروموزمهای هسته (ملاراگنوو همکارانش ۱۹۹۳) انبساط سلولی مشخص حاصل شده برای رشد بعدی انتقال ژنی NahG در دمای معین را اثبات کرد.

سیتوکینین سالیسیلیک اسید رشد گیاه دمای پایین

بحث

دمای پایین یکی از مهمترین فاکتورهای زیست محیطی است که مدت رشد گیاه را به وسیله طولانی کردن چرخه سلولی زیاد می کند. چنین به نظر می رسد که تنظیم مدت چرخه سلولی با ستیوکینین ها و نیز سالیسیلیک اسید ارتباط دارد. ما دریافته ایم که مدت رشد گیاه با کاهش دما، طولانی تر می شود اما حتی در دمای ۴ درجه سانتیگراد، گیاهان تا رسیدن به بلوغ رشد می کنند و نهایتا همان اندازه ای را که گیاهان تحت شرایط کنترلی به آن می رسند (۲۳ درجه سانتیگراد) به دست می آورند (شکل ۱). این مشاهدات نشان می دهند که تحت فرآوری ما، رشد سلولها به زمان طولانی تری برای پیمودن چرخه سلولی نیاز دارد اما برنامه توسعه ای تغییر نمی کند و در این فرایند، تغییر مقادیر سیتوکنین و سالیسیلیک اسید نقشهای مهمی دارند. در ذرت، فرآوری ۴ درجه سانتیگراد نشانه های معین در طی شب، برگهای کمی کوتاه تری همراه با سلولهای کوچکتر، چرخه های سلولی طولانی تر اما اندازه سلول بالغ بدون تغییر ایجاد کردند (ریمن و همکارانش ۲۰۰۷).

در نتیجه، مجاورت طولانی مدت با دمای پایین مدت زمان چرخه سلولی را افزایش می دهد و منجر به کاهش رشد گیاه می شود. این تغییر در مقادیر سیتوکینین و سالیسیلیک اسید ممکن است بخشهایی از مسیری باشد که پاسخ گیاهان در این وضعیت را تنظیم می کند و نتیجه ای از رونوشت (نسخه برداری) بالاتر یا سریعتر ژنهای CBF نیست. چنین فرض می شود که در دمای پایین افزایشی در مقدار سالیسیلیک اسید و کاهشی در مقدار سیتوکینین در گیاهان وجود دارند که ممکن است به صورت منفی رشد گیاه را از طریق کنترل مقدار تجلی ۱؛ CYCD3 تنظیم نمایند.