روش‌های تهیه اسپرم

روش‌های تهیه اسپرم – ایران ترجمه – Irantarjomeh

مقالات ترجمه شده آماده گروه بهداشت خانواده

مقالات ترجمه شده آماده کل گروه های دانشگاهی

مقالات

روش‌های تهیه اسپرم

اسپرم تمامی پستانداران از جمله انسان، در صورت تماس مستقیم با تخمک پس از فرآیند انزال توانایی بارور ساختن تخمک را دارا نمی‌باشد. برای این منظور اسپرم باید یک دوره بلوغ نهایی را طی کند که در طی آن دوره، توانایی برخورد و واکنش با تخمک و بارورسازی آن را بدست خواهد آورد. این فرآیند که توسطchang , Austin در سال ۱۹۵۱ کشف گردید . به عنوان کاپاسیتاسیون (فرآیند تکاملی اسپرم در دستگاه تولید مثل انسان یا حیوان ماده) نامگذاری شد. اسپرم موجود در مایع انزال در مقابل چندین فاکتور از بین برنده ظرفیت باروری موجود در پلاسمای مایع منی محافظت می‌شود. کاپاسیتاسیون اسپرم برای باروری نه تنها در محیط طبیعی بدن بلکه در فرآیندهای باروری آزمایشگاهی ( IVF) نیز امکان‌پذیر می‌باشد.

پلاسمای مایع منی نه تنها دارای فاکتورهای از بین برنده ظرفیت باروری است تا از کاپاسیتاسیون خود به خود اسپرم در فرآیند انزال جلوگیری کند، بلکه حاوی فاکتورهایی است که در تماس‌های طولانی با اسپرم می‌تواند بر روی عملکرد اسپرم در مواردی همچون توانایی نفوذ به مخاط رحم و انجام برخی واکنش‌ها در محیط آزمایشگاه و به طور کلی بر فرآیند باروری تأثیرگذار باشد.

بر این اساس برای آنکه اسپرم توانایی بارورسازی تخمک را داشته باشد باید از پلاسمای مایع منی جدا شود. جداسازی اسپرم از پلاسمای مایع منی به عنوان یکی از پیش‌نیازهای اساسی سلول اسپرم برای به دست آوردن توانایی بارورسازی مطرح می‌باشد. در روش‌های کمک باروری (ART) در آزمایشگاهها این نیاز در فرآیندی به نام شستشوی اسپرم برآورده می‌شود که در آن اسپرم از پلاسمای مایع منی گرفته شده و در محیط مناسب قرار می‌گیرد. تماس طولانی مدت ( بیش از ۳۰ دقیقه ) اسپرم با پلاسمای مایع منی می‌تواند به طور قابل ملاحظه‌ای ظرفیت اسپرم انسان را برای باروری در محیط آزمایشگاه کاهش دهد. نگهداری اسپرم تهیه شده همراه با فقط مقدار کمی پلاسمای مایع منی می‌تواند باعث کاهش و یا حتی مهار کامل ظرفیت‌پذیری باروری اسپرم گردد. بنابراین سلول اسپرم برای روش‌های درمانی از قبیل IUI یا IVF و یا آزمایشهای خاص نظیر تعیین توانایی باروری اسپرم باید از محیط پلاسمای مایع منی جدا گردد.

روش‌های تهیه اسپرم

چهار روش برای دسترسی و تهیه اسپرم وجود دارد:

۱- رقیق‌سازی و شستشوی ساده

۲- انتقال اسپرم (از محیط مایع منی به محیط شستشوی اسپرم)

۳- انتخاب روش شستشوی اسپرم (با کمک گرادیان‌های چگالی اسپرم)

۴- روشهای آشکار ساختن برای حذف مواد زاید و اسپرم‌های مرده (نظیرglass beads , glass wool )، ( Sephadex Columns ). این موارد در مبحثی دیگر به طور کامل مورد بررسی قرار می‌گیرد.

در انتهای دهه ۱۹۸۰،Aitken  و  Clarksonدریافتند که ظروف آزمایشگاهی سانتریفوژ نمونه‌های اسپرم می‌تواند رادیکال‌های آزاد اکسیژن تولید کند که تأثیرات مخربی بر روی توانایی باروری اسپرم در محیط  آزمایشگاه دارد. با وجود این، ترجیح می‌دهم که بطور دقیق منابع موجود را بررسی کنم تا دریابم تقسیمهای آزمایشگاهی عملکرد اسپرم و IVF که برای تهیه اسپرم به کار می‌روند، و در طی آنها مرحله سانتریفوژ وجود دارد، می‌تواند بر عملکرد اسپرم تأثیرگذار باشد و یا توانایی باروری اسپرم را کاهش دهد یا خیر. بحث اصلی این است که قابلیت خطر موجود برای شستن اسپرم‌ها با سانتریفوژ را باید کنار بگذاریم. اگر می‌خواهیم این روش را همانند تکنیک شستن مستقیم اسپرم از نمونه مایع منی و سانتریفوژ براساس گرادیان غلظتی بدانیم، ارتباط ارائه شده بین واژه « شستشوی اسپرم » و سانتریفوژ نمودن ساده و معمولا تکراری بوده و قرار دادن سلول‌های اسپرم در محیط کشت جدید‌ به نظر مناسب می‌باشد. عباراتی نظیر تهیه اسپرم نیز در هنگامی به کار رود که ما تکنیک‌های انتقال و سانتریفوژ را براساس گرادیان غلظتی اسپرم شرح می‌دهیم.

هدف این مقاله، بررسی و مرور منابع مهم موجود در مورد تهیه اسپرم از سال ۱۹۹۰ به بعد است تا یک سبک مناسب تهیه اسپرم برای روش‌های نوینART  فراهم شود.

روش‌های تهیه اسپرم

 آیا بکارگیری سانتریفوژ واقعا مضر است ؟

براساس یک عبارت ساده فیزیکی، سانتریفوژ می‌تواند برای سلول‌های اسپرم انسانی مضر باشد. بسیاری از آزمایشگاه‌ها به آسیب‌های ناشی از رادیکال‌های آزاد اکسیژن اشاره دارند. اگرچه بسیاری از محققان بررسی این سؤال را از طریق طراحی مطالعات و فرضیات بالینی و آزمایشگاهی می‌دانند،‌ بقیه آنها در جستجوی رد کردن این ادعا از طریق ترسیم این مسئله در موقعیتهای خاص خود، به خصوص کارکردن با نمونه‌های مایع منی غیرطبیعی و پارامترهای مایع منی غیرطبیعی کمتر توضیح داده شده، می‌باشند. این مسئله برای آن‌ها مشکل معنی‌دار آماری نمی‌باشد. دیگران اگر چه گرادیان‌های بالاتری را برای بدست آوردن اسپرم تشریح کردند، ولی تفاوت مشخصی از نظر عملکرد اسپرم‌ها ( واکنش‌های آکروزومی و اتصال اسپرم به زوناپلوسیدا ) بین این اسپرماتوزواها و اسپرم‌هایی که بطور همزمان و به موازات این روش از تکنیک‌های شستشو و غوطه‌ورسازی اسپرم بدست می‌آید، وجود ندارد. این مطالعه بر روی یک مجموعه ۱۲ موردی نمونه مایع منی مردان بارور سالم تحقیقاتی انجام گرفت. هیچ یک از مطالعات متعاقبی که ذکر می‌شود، مطلبی حقیقی در مورد آزمودن بیماران با اختلالات عملکرد ایاتروژنیک اسپرم ارائه نکردند و هم به یافته‌هایی نظیر یافته‌هایی که Guerin و همکارانش در یکسری از بیماران IVF بدست آوردند، به عنوان مدرک غیرقابل بحث و بدون مناقشه در مورد القای اختلالات اسپرم، اشاره دارند. یافته‌های در حال رشد کنونی ما در مورد مکانیسم‌های که بوسیله آن  اسپرم‌های غیرطبیعی از نظر شکل همراه با سیتوپلاسم باقی مانده و لکوسیت‌های موجود در مایع انزال رادیکال‌های آزاد را در محیط آزمایشگاه تولید می‌کند، مکانیسمی را برای تشریح این مشکل فراهم نموده است. این مسئله بطور حتم هیچ تأثیری بر هیچ مردی، به خصوص مردانی که دارای کیفیت اسپرم طبیعی هستند نخواهد داشت.

اما در گروه مردان نابارور، که گروه کوچکی را تشکیل می‌دهند، باید به اکثر آن‌ها گوشزد شود که خطر آسیب رسیدن به اسپرم‌هایشان در طی آماده‌سازی برای ART وجود دارد.

بنابراین، همچنان بحث ابتدایی صحیح است که ظرف‌های آزمایشگاهی سانتریفوژ اسپرم، می‌تواند باعث آسیب غیرقابل برگشت بر روی توانایی بارورسازی اسپرم‌ها شود. بنابراین روش‌هایی که شامل هرگونه مرحله شستشوی اسپرم هستند و در طی آن اسپرم با سانتریفوژ و انتقال به محیط جدید، رقیق می‌شود، بدون توجه به آنکه ظروف آزمایشگاهی فقط شسته می‌شود و سلول‌های اسپرم دوباره معلق شده و یا اجازه حرکت کردن و غوطه‌وری در درون ظرف شسته شده را داشته باشند، باید به عنوان خطر بالقوه کشنده بر روی اسپرم‌های تهیه شده مورد توجه قرار گیرد. در نتیجه باید هر فعالیتی که به عملکرد فیزیولوژیک اسپرم تهیه شده  ربط دارد را مورد توجه قرار داد. در نتیجه، باید برای هر فعالیتی که به عملکردهای فیزیولوژیک اسپرم تهیه شده نیاز دارد را مدنظر قرار داد. روشهای جایگزین اسپرم گرفته شده نظیر حرکت مستقیم از مایع منی (همراه با شستشوی متعاقب آن با مرحله شستشوی سانتریفوژ به محیط جدید) ایمن به نظر می‌رسد. زیرا سلول‌های تولید‌کننده رادیکال‌های آزاد اکسیژن باید از اسپرم جدا شوند و یا باید سانتریفوژ براساس گرادیان غلظت بعنوان جایگزین به کار رود. اگرچه موفقیت روش‌های بدست آوردن اسپرم ‌غالبا براساس مقدار اسپرم متحرک جدا شده ارزیابی می‌شوند، حیاتی است که اسپرم آماده شده برای استفاده بالینی، از هرگونه آلودگی میکروبیولوژیکی مایع منی پاک گردد. سایر موارد مهم برای انتخاب روش تهیه اسپرم، پیچیدگی‌های فنی هر روش، هزینه مواد و فرد انجام دهنده و همچنین زمان انجام می‌باشد. باید از هرگونه تماس ممکن اسپرماتوزوئید در طی فرآیند آماده‌سازی با عوامل مخرب که باعث ایجاد اختلال ایاتروژنیک اسپرم می‌شود، جلوگیری نمود.

روش‌های تهیه اسپرم

روش‌های بی‌خطر برای جمع‌آوری اسپرم

اگرچه لیست تمام روشهایی که در این مقاله تشریح شده است ‌کامل نیست، روش به کارگرفته شده براساس ایمن بودن و یا عدم ایمنی (برای اجتناب از خطر تولید رادیکال آزاد اکسیژن ) مد نظر است.

منی با حالت شناوری مستقیم

این روش، اولین روشی است که توسط محققانی که بر روی فیزیولوژی اسپرم انسانی تا اواخر دهه ۱۹۵۰ کار می‌کردند به کار گرفته می‌شد. مایع منی بر روی محیط کشت و یا محیط کشت بر روی مایع منی، به صورت لایه‌لایه قرار ‌گرفته و در طی دوره انکوبالیون که بین ۱۵ تا ۶۰ دقیقه بسته به نوع فعالیت متفاوت است، اسپرم‌های کاملا متحرک از محیط مایع منی به سمت محیط کشت حرکت می‌کنند. ظرفیت این مرحله انتقال از لحاظ عملکردی معادل فرآیندی است که در آن اسپرم انسانی از مایع انزال خارج شده  و در موکوس گردن رحم قرار می‌گیرد.

روشهای چسبندگی

این روش‌ها نباید بطور مستقیم برای اسپرم مضر باشند زیرا مراحل قبل از شستشوی اسپرم را شامل نمی‌شوند. اگرچه روش به کار گرفتن فیبرهای شیشه‌ای ( که ماده نهایی بر روی آن قرار می‌گیرد ) باید به دقت، قبل از آنکه برای کاربرد بالینی نظیر تهیه اسپرم جهت IUI به کار گرفته شود، مورد توجه قرار گیرد. تنها مطالعات محدود و کمی برای مقایسه بین روش‌های چسبندگی ( اتصال ) با سایر روش‌ها نظیر غوطه‌وری در مایع منی (DSUS) و گرادیان چگالی انجام شده است. در حالیکه، نسل دوم ستون‌های تهیه اسپرم به مایع منی شسته نشده نیازی ندارند.

گرادیانهای متراکم

براساس مطالعات اولیه ( Beatty, 1964 ) نشان داده شده که اگرچه سیلیکای کلوئیدال اجازه جداشدن isopycnic اسپرم را می‌دهد، باروری این سلولها مشکلاتی را فرا روی قرار داده و این روش تنها با ورود سیلیکا کلوئیدال اصلاح شده در اواخر دهه ۱۹۷۰ به صورت یک روش کارآمد عرضه شد. پوشاندن ذرات سیلیکا با پلی‌ونیل پیرولیدون (PVP) توسط Hakan pertoft شروع گردیده  و بهنگامی که در اواخر دهه ۱۹۸۰ گرادیان چگالی به عنوان یکی از روش‌های تهیه اسپرم مطرح شد این فرآیند به صورت تجربی به کارگرفته شد. این مسئله یک نوآوری بزرگ در روش‌های       فراهم‌سازی اسپرم به صورت بالینی و آزمایشگاهی بود. خصوصیات متعدد سیلیکای کلوئیدال، این ماده را بعنوان یک صافی مطلوب برای استفاده در گرادیان‌های چگالی جهت انتخاب سلول اسپرم انسانی مطرح ساخته بود. اولا، این ماده به عنوان یک ماده معدنی به هنگامی که به محیط اضافه می‌شود دارای هیچگونه اثر اسمزی یا تراوشی نمی‌باشد. ثانیا، این ماده اجازه می‌دهد تا یک محیط با چگالی بالا تولید شود و این مسئله از این نظر اهیمت دارد که سلول اسپرم انسانی یک سلول متراکم است. ثالثا، این ماده نسبت به محلول ویسکوزیته کمتری داشته و در نتیجه باعث تاخیر در رسوب سلول‌های اسپرم نمی‌شود. اگرچه برخی از نویسندگان در روزهای ابتدایی کاربرد گرادیان‌های پیوسته پریکول (percoll) را گزارش نمودند، ولی کاربردهای بالینی این روش تا اواخر دهه ۱۹۸۰ با استفاده از روش گرادیان‌های غیرپیوسته صورت می‌گرفت. گرادیان‌های غیرپیوسته معمولا در طی ۲ یا ۳ لایه ایجاد می‌شوند. در حالیکه در این روش برخی از موارد خاص با وجود ۱۲ لایه گزارش شده است. مواد دیگر ایجاد کننده گرادیان چگالی، نظیر ساکاروز، کلریدسزیوم نیکول و Metrizamide به خاطر ایجاد محلول هیپرتونیک با ویسکوزیه بالا قابل استفاده نبودند.

روش‌های تهیه اسپرم

پریکول سگا

در اکتبر ۱۹۹۶، بسیاری از آزمایشگاه‌های سراسر جهان نامه‌ای از کارخانه بیوتک دریافت کردند که اظهار می‌کرد پریکول را نباید برای موارد بالینی به کار برد و کاربرد این ماده می‌بایست منع شود. شرکت بیوتک وظیفه اخلاقی و قانونی خود دانسته بود که ما را مجبور کند تا استفاده از  پریکول را فقط برای اهداف تحقیقاتی محدود کنیم و از آن برای اهداف بالینی انسان استفاده نکنیم. این مسئله را شرکت فوق تنها به آزمایشگاهها خاطرنشان نساخته بلکه این هشدار برای هرکسی بود که سلول‌ها را برای مصارف درمانی انسان‌ها، جداسازی می‌نمود.

این مسئله باعث ایجاد یک هیجان و اضطراب خاموش در بین گروه‌های اینترنتی تخصصی نظیر Embryomail , Andrologg شد. بسیاری از محققان می‌خواستند بدانند به عنوان قدم بعد چه باید بکنند؟ به خصوص اینکه بسیاری از آن‌ها اعتقاد داشتند که چون آن‌ها برای سالیان متمادی پریکول را به صورت ایمن به کار برده‌اند، اکنون هم می‌توانند بر خلاف آگهی شرکت بیوتیک آن را به کار برند. به خصوص اگر آن‌ها پشتیبانی پریکول را از شرکت‌های دیگر نظیر Sigma خریده نموده بودند. چون شرکت بیوتک تنها تولید کننده ( تولید کننده انحصاری ) پریکول بود شرکت‌هایی نظیر Sigma مجموعه کامل آن را خریداری نموده و دوباره آن را آماده نمودند. با توجه به این مسئله بسیاری از شرکتها آماده ساختن کیت‌های گرادیان براساس پریکول بودند و تمامی این کیت‌ها هنوز دارای برچسب‌ فقط برای استفاده آزمایشگاهها و یا فقط برای کاربرد تحقیقاتی بود و هیچکدام برای کاربرد خاص در تهیه اسپرم و استفاده در روش‌های بالینی انسانی ART فروخته نشده بود. پس از آن، مشخص شد که برخی از  دسته‌های به کار رفته در پریکول حاوی ترکیبات اندوتوکسین بالا بوده است که بالاتر از مقدار مجاز برای تجویز در داخل بدن است و می‌تواند بر روی بقای اسپرم و یا تکامل تخم تشکیل شده تأثیرات مخرب داشته باشد. این مسئله در ایالات متحده آمریکا مبهم‌تر بود زیرا دولت آمریکا هنوز IVF را نمی‌شناخت. در همان زمان اگرچه مرکز تجویز غذا و داروی آمریکا (FDA) مجوز تولیدات برای استفاده از IUI را صادر می‌کرد، این مرکز مجوز تولیداتی که در IVF بکار می‌رفت را نمی‌داد. بسیاری از کارمندان، معتقد بودند که شرکت پریکول حق نداشته است تا استفاده آن‌ها را از پریکول بدین صورت متوقف سازد، ولی واضحا این اظهارات نادرست بود و هر کسی که به استفاده از پریکول پس از زمان ممنوعیت بپردازد ریسک مرتبط با خطرناک پزشکی ـ قانونی را متحمل شده است.

در شماره جولای The Embryologist 1997، مجله انجمن جنین‌شناسی  (ACE) انگلستان، مقاله‌ای به قلم David Morroll یکی از اعضای کمیته اجرایی ACE  وجود داشته که یک مرور غیروابسته به گزینه‌های قانونی را بر روی نیاز به کاربرد تولیدات مخصوص ART انجام داده بود. در آن مقاله Morroll اشاره داشت که اگر یک شرکت سازنده خاطرنشان سازد که تولیداتش را فقط در یک روش می‌توان به کارگرفت ( مثلا فقط برای اهداف تحقیقاتی ) انحراف از آن می‌تواند برای کاربران خطرناک باشد و از اینرو وی نتیجه‌ گرفت که، «آیا باید چنین مواردی را بدون داشتن مجوز لازم مورد استفاده قرار داد، هیچ توجیهی در این خصوص وجود ندارد» و اظهار می‌دارد که، «حتی می‌توان گفت که در صورت استفاده خاطی از وظایف خود تخطی نموده و بعلاوه سازندگان ممکن است در صورتی که محصول آنها به صورت غیرمجاز استفاده ‌شود تمایل به اتخاذ تصمیمات قانونی بر علیه استفاده کننده و اعمال واکنشهای قانونی داشته باشند. اگر یک وسیله غیر ART به کار برده شود و باعث بروز مرگ و میر شود، در تئوری این مسئله می‌تواند به یک روند کیفری ختم شود، شاید اتهام قتل غیر عمد یا حتی قتل نفس، اگر بی‌پروا باشیم. از این رو اندیشمندان حوزه قانون در انگلستان از سه سال پیش تشخیص دادند که مسؤلیت موارد بعهده روش کلنیک‌های ART و محققانی است که منحصرا از وسایل اختصاصی ART استفاده می‌کنند. هرچند مطالعه‌ای که ACE در همان زمان انجام داد نشان می‌دهد که تنها ۲ کلینیک در انگلستان خود را ملزم به رعایت این سیاست می‌دانستند و بقیه کلینیک‌ها اعتقاد داشتند که باید تغیراتی در سیاست کنونی اعمال شود.

روش‌های تهیه اسپرم

مدیوم یا بافر

از آنجائیکه مرحله سانتریفوژ به جای محیط غنی گشته از Co_2، در هوا انجام می‌گیرد پیشنهاد می‌شود که گرادیان‌های چگالی یک محیط باروری HEPES را به جای محیط دارای بی‌کربنات به کار ببرند. با این وجود، به دلیل آنکه ظرفیت‌پذیری اسپرم به حضور غلظت‌های بالای یون کربنات نیاز دارد، مرحله شستشو و سوسپانسیون مجدد نهایی باید در محیط غنی از بی‌کربنات انجام شود. در غیر این صورت،  ظرفیت‌پذیری و متعاقب آن باروری در محیط آزمایشگاه وجه‌المصالحه قرار گیرد. برای آماده‌سازی IUI، بافر را می‌توان بکار برد، زیرا باید به مقدار بسیار زیادی پس از تلقیح رقیق گردد و در صورتی که اسپرماتوزوا در محیط آزمایشگاهی در طی دوره کمون طولانی قبل از تلقیح تحت کاپاسیتاسیون قرار می‌گیرد، فعالیت بیش از حد و جنبندگی آن می‌تواند توانایی آن‌ها را برای عبور از تقاطع لوله‌های رحمی فراهم سازد. اما اگر تلقیح درست پس از تهیه اسپرم انجام شود، می‌توان از محیط کشت به صورت ایمن استفاده نمود.

آیا باید آنتی‌اکسیدان‌ها را در محیط یا ظرف مخصوص آماده‌سازی اسپرم قرار دهیم؟

بدلیل آنکه اسپرم‌ها در طول فرایند آماده‌سازی با اثرات زیان‌آور متعدد رادیکال‌های آزاد اکسیژن روبرو ‌شوند گروهی از کارمندان آزمایشگاه‌ها معتقدند که باید مواد آنتی‌اکسیدان ( نظیر گلوتاتیون) را به فرمول ساخت محیط‌های اسپرم اضافه نمود. اگرچه شواهد کمی از این مقوله پشتیبانی می‌کنند، مطالعات جامع‌تری قبل از استقرار ارزشهای این مفهوم مورد نیاز می‌باشد.