رئوتری لاکتوباسیلوسPg4 خواص پروبیوتیک چسنبدگی

رئوتری لاکتوباسیلوسPg4 خواص پروبیوتیک چسنبدگی – ایران ترجمه – Irantarjomeh

مقالات ترجمه شده آماده گروه کشاورزی

مقالات ترجمه شده آماده کل گروه های دانشگاهی

مقالات

چگونگی سفارش مقاله

الف – پرداخت وجه بحساب وب سایت ایران ترجمه(شماره حساب)ب- اطلاع جزئیات به ایمیل irantarjomeh@gmail.comشامل: مبلغ پرداختی – شماره فیش / ارجاع و تاریخ پرداخت – مقاله مورد نظر --مقالات آماده سفارش داده شده پس از تایید به ایمیل شما ارسال خواهند شد.

خواص پروبیوتیک و چسنبدگی رئوتری لاکتوباسیلوس Pg4 با قابلیت بیان بتاگلوکاناز میکروبی شکمبه

چکیده

این مطالعه نسبت به ارزیابی پتانسیل رئوتری لاکتوباسیلوسPg4  تغییر شکل یافته (T-Pg4) که  شامل  ژن  بتاگلوکاناز  به عنوان  یک پروبیوتیک یا زیست یار ماکیانی تلقی می شود  اقدام  می نماید. خواص این پروبیوتیک سویه T-Pg4 تحت محیط آزمایشگاهی از طریق قابلیت اتصال یا چسبندگی و مشخص نمودن مقاومت و تحمل در برابر محیط اسیدی و املاح صفرایی مورد بررسی قرار گرفته است. بعلاوه شرایط محیط طبیعی از طریق قابلیت تداوم زیست و اتصال یا چسبندگی به مجاری روده ای (GIT) مرغ هایی که دارای هیچگونه علامت بیماری خاص (SPF) نمی باشند نیز مورد بررسی قرار گرفته است. نتایج نشان دهنده آن هستند که سویه T-Pg4 قابلیت مقاومت تحت شرایط اسیدی و تماس با املاح صفرایی را داشته و به طور مؤثری قابلیت چسبیدن به سلول های چینه دان و اپیتلیال یا مخاطی روده ای مرغ ها تحت محیط آزمایشگاهی را خواهند داشت. سویه T-Pg4 نیز قابلیت تداوم زیست و تشکیل کلنی اپیتلیوم معده ای روده ای مرغ های SPF آزمایشی تحت شرایط طبیعی را خواهد داشت. به علاوه، نفوذ آنزیم شعاعی / رادیال نیز جهت نشان دادن این موضوع که لاکتوباسیلوس SPP به طور تصادفی قابلیت جداشدگی از GIT مرغ های SPF با ویژگی تغذیه شدگی T-Pg4 و با قابلیت تراوش بتاگلوکاناز را دارد نیز نشان داده شده است. این یافته ها مشخص کننده آن می باشند که L. رئوتری Pg4 قابلیت بقا با توجه به عبور از مجاری شکمی و روده ای را داشته و همچنین احتمال پنهان سازی بتاگلوکاناز در GIT مرغ نیز میسر است. بنابراین، این موضوع  پیشنهاد  می شود که چنین ارگانیسمی را می بایست به عنوان یک پروبیوتیک ماکیانی چندکنشی بکار گرفت.

کلمات کلیدی: بتاگلوکاناز، رئوتری لاکتوباسیلوس Pg4، پروبیوتیک / زیست یار، ارزیابی تحت شرایط آزمایشگاهی.

رئوتری لاکتوباسیلوسPg4 خواص پروبیوتیک چسنبدگی

مقدمه

برای سالیان متمادی، مواد افزودنی ضد باکتری، شامل برخی از آنتی بوتیک ها برای مداوای بیماری ها و همچنین به منظور رشد بیشتر ماکیان بکار گرفته شده اند. با این وجود، با توجه به افزایش دل نگرانی عمومی در ارتباط با پسماندهای آنتی بیوتیکی و افزایش میزان مقاومت آنتی بیوتیک، استفاده از آنتی بیوتیک در برخی از نواحی جهان به طور اکید ممنوع شده است. اضافه نمودن پروبیوتیک ها جهت تغذیه به عنوان یکی از راهکارهای جایگزین بجای آنتی بیوتیک مد نظر می باشد. پروبیوتیک ها، که حاوی ارگانیسم های زیست پذیر می باشند و دارای نوعی تأثیر سودمند بر روی عملکرد حیوانات از طریق اصلاح میکروفلورا یا ریز گیاهان روده معده ای آنها هستند، به عنوان یک پتانسیل قدرتمند هم برای مصرف غذایی و هم به عنوان جایگزین آنتی بیوتیک ها مدنظر قرار گرفته اند (Reid و Friendship، ۲۰۰۲). شواهد کافی در خصوص این مورد وجود دارد که پروبیوتیک ها برای ارتقای سیستم ایمنی نیز مفید می باشند و سبب افزایش بهره وزن بدن، کاهش اسهال، و ارتقای فرایند تبدیل غذایی به طور کارآمد می شوند (Patterson و Burkholder، ۲۰۰۳). پروبیوتیک هایی  که  هم اکنون  مورد  استفاده  قرار  می گیرند یا پروبیوتیک های تحقیق شده غالباً از میکروفلوراهای احشامی یا شکمبه ای طبیعی حاصل می شوند، که در این زمینه انتخاب سویه های بهینه به عنوان یک ویژگی کاملاً عملی مدنظر می باشد. بر این مبنا چنین فرض می شود که اصلاح ژنتیکی را می توان جهت توسعه و ایجاد پروبیوتیک های کارآمدتر و مؤثرتر بکار گرفت. مثال های چنین نوع از پروبیوتیک های اصلاح شده شامل سویه هایی هستند که قابلیت تولید آنتی بیوتیک ها، آنزیم های سم زدایی و سیتوکین برای تداخلات ایمنی را خواهند داشت (Steidler، ۲۰۰۳).

…

در بررسی کنونی، ما نسبت به مطالعه ویژگی های پروبیوتیک نظیر قابلیت اتصال، مقاومت اسیدی و مقاومت در برابر املاح صفرایی سویه T-Pg4 در محیط آزمایشگاهی اقدام نمودیم. ما همچنین نسبت به بررسی قابلیت دفع بتاگلوکاناز و تداوم زیست لاکتوباسیلی تغییر شکل یافته در GIT مرغ های عاری از هر گونه علایم بیماری خاص که با این L. رئوتری Pg4 تغییر شکل دهنده نموده بودند اقدام کردیم.

رئوتری لاکتوباسیلوسPg4 خواص پروبیوتیک چسنبدگی

مواد و روش ها

سویه باکتری آزمایشی

سویه رئوتری لاکتوباسیلوس Pg4 بکار گرفته شده در این مطالعه از بخش روده ای جوجه های سالم حاصل آمده و به صورت موفقی به ژن فیبروباکتر سوسینوژن بتاگلوکاناز تبدیل شد (Liu و همکاران، ۲۰۰۵). این ژن رئوتری لاکتوباسیلوس Pg4 و مواد تغییر دهنده آن (T-Pg4) در دمای منفی ۸۰ درجه سلسیوس تحت شرایط کشت آزمایشگاهی قرار گرفت. پس از دو راهکار انتقال و رشد پیاپی در دمای ۳۷ درجه سلسیوس در آبگوشت MRS (De Man، Rogosa، Sharpe) (لابراتوار Difco Laboratories، Detroit، Michigan، ایالات متحده) و متعاقباً در آبگوشت MRS حاوی کلروآمفنیکل (۱۰ μg/ml) به ترتیب اعمال شد.

ارزیابی خواص پروبیوتیک L رئوتری Pg4 تحت شرایط آزمایشگاهی

مقاومت در برابر اسید و املاح صفرایی رئوتری لاکتوباسیلوس Pg4: یک میلی لیتر از بخش کشت شبانه ای L. رئوتری Pg4 یا سویه T-Pg4 والدینی تحت فرایند سانتیریفوژ قرار گرفت (۷۰۰۰ دور در دقیقه، به مدت ۵ دقیقه)، متعاقباً ظروف مربوطه در یک بافر فسفات نمکی (PBS) با pH 0/2 تعدیل شده تحت فرایند سوسپانسیون قرار گرفته و در دمای ۳۷ درجه سلسیوس آنکوبه شدند. پس از ۰، ۱ و ۳ ساعت، بخش های ۱ میلیمتری سوسپانسیون برداشت شده و به صورت سریال با PBS (pH 4/7) ترقیق گردیده و بخش های دیگر در ظروف آگار MRS برای تعیین وجود کلنی تشکیل دهنده واحدها پراکنده گردیدند. به منظور آزمایش مقاومت لاکتوباسیلوس در برابر املاح صفرایی، پس از تیمار با اسید سلول های زنده به وسیله فرایند سانتیریفوژ جمع آوری گردیده و متعاقباً با PDS شسته شدند. آنها مجدداً تحت فرایند سوسپانسیون (۱%) در آبگوشت MRS قرار گرفته، با یا بدون ۳/۰% آکسگال (Bile، Sigma B-3883) و متعاقباً در دمای ۳۷ درجه سلسیوس آنکوبه شدند. بخش های ۱ میلیمتری نیز از ظروف آزمایشگاهی پس از ۰، ۲، ۴، ۶، ۸، ۱۰، ۱۲ و ۲۴ ساعت برای تعیین ویژگی جذب در طول موج ۵۷۰ نانومتر برداشت شدند. تحمل املاح صفرایی نیز به صورت (%) = برآورد شد (شیب منحنی جذب در آبگوشت MRS به میزان ۳/۰% آکسگال مشخص شد) / (شیب منحنی جذب آبگوشت MRS بدون آکسگال ۳/۰%) x 100 (Gilliland و Walker، ۱۹۹۰، Toit و همکاران، ۱۹۹۸) .

ارزیابی زیست پذیری رئوتری لاکتوباسیلوس Pg4 تغییر شکل یافته در مرغ های SPF

طراحی آزمایشی: یک مجموعه از ۲۰ مرغ SPF تخم گذاشته جدید از شاخه بررسی داروهای حیوانات، انستیتو تحقیقاتی بهداشتی حیوانات، شورای کشاورزی تایوان حاصل آمد. آنها از نظر تشخیص پادتن بیماری بورس (IBD)، آلودگی های برونشیتی (IB)، مایکوپلاسما گالینارم (MG) و مایکوپلاسما سینوویت (MS) منفی گزارش شدند. مرغ ها به صورت تصادفی به گروه های پروبیوتیک و گروه های شاهد انتخاب شدند. به مرغ های گروه پروبیوتیک (۱۰ مورد) میزان ۱ میلی لیتر (۱´۱۰^۸ CFU/ml) آبگوشت T-PG4، جوجه های ۱، ۲ و ۳ روزه، خورانده شد، در حالی که گروه شاهد (۱۰ مورد) نیز با استفاده از ۱ میلی لیتر آب مقطر با توجه به روزهای فوق تحت کنترل قرار گرفتند.

نتایج آماری

کلیه نتایج با استفاده از بسته نرم افزاری سیستم تحلیل آماری (نگارش version 6.1، SAS، ۱۹۹۹) تحلیل شدند. تحلیل آماری میزان تعداد باکتری ها پس از تبدیل لگاریتمی داده ها مشخص شد. نتایج به صورت میانگین های means±SD ارائه شدند. آزمون ـ t جهت تشخیص میانگین های تیمار مختلف اعمال شد.

رئوتری لاکتوباسیلوسPg4 خواص پروبیوتیک چسنبدگی

نتایج و مباحث

تحمل اسید و املاح صفرایی سویه های Pg4 رئوتری لاکتوباسیلوس

هر دوی سویه های L. رئوتری که در اینجا آزمایش شدند پس از ۳ ساعت آنکوبه شدگی تحتpH  ۰/۲ (جدول ۱) باقی ماندند. سویه Pg4 L. رئوتری والدینی نیز پس از ۳ ساعت آنکوبه شدگی در تحتpH  ۰/۲ همچنان به تداوم زیست ادامه داده، در حالی که سویه T-Pg4 معرف ۹۰/۰ الی ۰۰/۱ ـ log کاهش در شمارش ها پس از تیمار مشابه بوده است. بنابراین، تحمل اسیدی سویه T-Pg4 کمتر از سویه والدینی می باشد. به علاوه، ما همچنین مشخص ساختیم که هر دوی سویه های والدینی و سویه های Pg4 L. رئوتری در یک دوره آنکوبه شدگی ۲۴ ساعتی در آبگوشت MRS حاوی ۳/۰% آکسگال قابل زیست هستند (جدول ۱). تحمل نمک صفرایی سویه Pg4 L. رئوتری و سویه T-Pg4 به میزان ۸/۸۹% و ۷/۸۷% به ترتیب مشخص شد.

قابلیت چسبیدگی سویه T-Pg4

اتصال یا چسبیدگی به عنوان یکی از معیارهای غلبارگری مهم برای پروبیوتیک است. قابلیت باکتری پروبیوتیک جهت چسبیدن یا اتصال به مخاط روده ای به عنوان یک ویژگی مهم برای کلنی سازی گذرا، انتاگونیسم در برابر پاتوژن ها، مدولاسیون سیستم ایمنی و ارتقای سلامت مخاط های صدمه دیده شکمی تلقی می شود (Jin و همکاران، ۱۹۹۷، Strompfova و همکاران، ۲۰۰۴). مشکلات در ارزیابی چسبیدگی سویه های پروبیوتیک تحت شرایط محیط زنده سبب توسعه آزمایشات چسبیدگی تحت شرایط آزمایشگاهی شده است. سلول های مختلف کشت شده، نظیر Int 407، Caco-2 و HT-29، و سلول های اپیتلیال جدایه از بخش های چینه دان و مجاری روده ای برای آزمایش چسبیدگی پروبیوتیک ها ارائه شده اند (Bouzaine و همکاران، ۲۰۰۵). در این مطالعه، ما از سلول های چینه و اپیتلیال روده ای مرغ جهت ارزیابی قابلیت چسبیدگی سویه های Pg4 L. رئوتری استفاده نمودیم. هر دوی سویه های والدینی Pg4 L. رئوتری و T-Pg4 به طور مؤثری قابلیت چسبیدگی به هر دو سلول های اپیتلیال روده ای تحت شرایط آزمایشگاهی را داشته و بنابراین به نظر هیچگونه تفاوتی بین قابلیت چسبیدگی سویه Pg4 L. رئوتری و سویه Pg4 L. رئوتری والدینی وجود ندارد.

توزیع لاکتوباسیلوس spp. در مجاری روده ای و مدفوع مرغ های SPF آزمایشی

جدول ۲ و ۳ نشان دهنده تأثیر مواد مکمل با یا بدون T-Pg4 بر حسب لاکتوباسیلوس spp. در بخش های مختلف GIT و همچنین مدفوع مرغ های SPF آزمایشی به ترتیب می باشند. لاکتوباسیل در آگار MRS مشخص کننده وجود کلرامفنیکل (۱۰ μg/ml) می باشد. کلرامفنیکل به عنوان یک نشانگر انتخابی آنتی بیوتیکی برای لاکتوباسیل تغییر شکل یافته در این مطالعه به شمار می آید (Liu و همکاران،  ۲۰۰۵). در سنین ۳ و ۷ روزه، هیچگونه باکتری در شمارش های روده ای یا در بافت های روده ای مرغ ها در گروه شاهد یافت نشد (جدول ۲). از طرف دیگر مکمل T-Pg4 سبب افزایش معنی داری در جمعیت لاکتوباسیلوس spp. در ارتباط با تعداد موارد یافت شده در ژژنوم، ایلیوم یا بخش پایینی روده و همچنین روده کور شده است و بر روی بافت ژژنوم و همچنین روده کور، در مقایسه با مرغ های گروه شاهد این ویژگی مشخص می باشد (p<0.05). نتیجه مشابه جمعیت لاکتوباسیلوس spp. در مدفوع نیز مشخص شد. گروه مکمل T-Pg4 دارای جمعیت معنی دار بیشتر لاکتوباسیلوس spp. در مدفوع می باشد (جدول ۳). این موارد معرف آن است که سویه T-Pg4 قابلیت تداوم زیست گذرا از طریق GIT را داشته و از قابلیت تداوم زیست در GIT مرغ نیز برخوردار است.

شناسایی فعالیت بتاگلوکاناز سویه لاکتوباسیلوس spp. از بخش روده ای به وسیله نفوذ آنزیم رادیال

فعالیت بتاگلوکاناز گونه های تبدیل شده و همچنین والدینیL.  رئوتری Pg4، و کلنی های کشت شده انتخابی تصادفی جدا شده از بخش های فوق الذکر مرغ در گروه پروبیوتیک با استفاده از ویژگی های نفوذ رادیال آنزیم مشخص شدند. برهمکنش رنگ قرمز کونگوی مستقیم با لیچنان دست نخورده که حاوی واحدهای دی ـ گلیکوفیرانسیل پیوندβ-(۱→۴)-  و β-(۱→۳)-linked هستند، فراهم آورنده مبنایی برای ارزیابی های سریع و حساس در ارتباط با پردازش سویه های باکتری فعالیت های بتاگلوکاناز می باشد (Wood، ۱۹۸۱). سویه Pg4 L. رئوتری والدینی هیچگونه ویژگی رادیال شفافی را نشان نمی دهد، که معرف آن می باشد که چنین موردی حاوی قابلیت ترشح بتاگلوکاناز را ندارد. در مقابل، ژن بتاگلوکاناز شامل T-Pg4 قابلیت تجزیه لیچنان و تولید رادیال های شفاف دائمی را خواهند داشت. به علاوه، لاکتوباسیلوس spp. جدا شده از بخش های مرغ گروه پروبیوتیک همچنین ارائه دهنده رادیال های شفاف آشکاری می باشد که معرف آن است که آنها همچنین حاوی ترشح بتاگلوکاناز نیز می باشند. چنین موردی معرف آن است که لاکتوباسیلوس جدا شده از بخش های روده ای جوجه ها می بایست به عنوان سویه Pg4 L. رئوتری تغییر شکل یافته در نظر گرفته شود.

رئوتری لاکتوباسیلوسPg4 خواص پروبیوتیک چسنبدگی

چسبندگی میکروبی در چینه دان و روده کور

آزمایش انجام شده با استفاده از میکروگراف الکترونیکی پویشی میکروفلروها در مخاط های چینه دان و روده بزرگ نشان دهنده میکروب های میله ای شکل می باشند که قابلیت کلنی در بخش مخاطی مرغ های گروه پروبیوتیک در سن ۷ روزه را خواهند داشت. به طور متقابل، این مورد نشان دهنده میکروب های نادر با قابلیت کلنی سازی در چینه دان و مخاط روده ای مرغ های گروه شاهد می باشند. این نتایج سازگار با نتایج نشان داده شده در جدول ۲ و ۳ می باشند، یعنی هیچگونه باکتری لاکتوباسیلوس spp. در مدفوع و بخش های شکمی مرغ ها در گروه شاهد دیده نشد.

در نتیجه، این موضوع مشخص شد که بکارگیری ژن فیبروباکتر سوسینوژن بتاگلوکاناز در سلول های Pg4 L. رئوتری به نظر دارای تأثیری بر روی خواص پروبیوتیک این گونه از سلول های باکتریایی نمی باشد. علاوه بر این نشان داده شد که لاکتوباسیلوس spp. گرفته شده از بخش های چینه دان، روده بزرگ و بخش پایینی روده باریک گروه پروبیوتیک دارای قابلیت ترشح بتاگلوکاناز می باشد، در حالی که ارگانیسم های قیاسی گروه شاهد این مورد را مشخص نمی سازند. چنین موردی اثبات کننده این مسئله است که سویه Pg4 L. رئوتری تغییر شکل یافته قابلیت تداوم زیست و ترشح بتاگلوکاناز در مجاری روده ای مرغ های SPF می باشند. این مورد همچنین مشخص کننده این موضوع می باشد که پروبیوتیک را می توان به عنوان عامل پروبیوتیک چند کاربردی یا چند کنشی مورد استفاده قرار داد و به عنوان یک حامل مفید جهت انتقال ژن های مفید برای تولید ماکیان به شمار می آید. برای کاربرد عملی در تولید جوجه، تأثیر این سویه Pg4 L. رئوتری ترانس ژنیک بر روی عملکرد رشد جوجه ها و میکروفلورای GIT تحت محیط تغذیه متعارف را می بایست متعاقباً مورد بررسی قرار داد.