siRNA و فرمول بندی ژن برای ژن درمانی کارآمد

siRNA و فرمول بندی ژن برای ژن درمانی کارآمد – ایران ترجمه – Irantarjomeh

مقالات ترجمه شده آماده گروه پزشکی

مقالات ترجمه شده آماده کل گروه های دانشگاهی

مقالات

siRNA  و فرمول بندی ژن برای ژن درمانی کارآمد

۱- مقدمه

RNA یا رنای تداخلگر کوچک (siRNA، که همچنین تحت عنوان RNA کوتاه تداخی نیز خوانده می شود) از تاریخچه متغیری در ارتباط با ویژگیهای اکتشافی و کاربرد اولیه آن برخوردار می باشد. در عین حال، جامعه تحقیقاتی “پستانداران” از دستاورهای تحقیقاتی “گیاهی”، چه از نکته نظر خواندن اطلاعات مرتبط یا اشاره بدانها، بهره ای نبرده است. بر این مبنل، هم اکنون با توجه به صرف بیلیون ها دلار سرمایه گذاری و هزینه مشخص شده است که ویژگیهای مرتبط با تداخل RNA (RNAi)، فرونشانی پسا نسخه برداری ژنی با توالی ویژه (PTGS) به وسیله siRNA، از پتانسیل کاربردهای درمانی بسیاری مطلوبی برخوردار است {۱} و چنین مبحثی به عنوان یک ابزار مهم در زمینه مطالعه ژن شناختی کاربردی به شمار می آید. ویژگی محلی و مکانیزم عملکرد siRNA مشخص می سازد که قابلیت تحویل این نوکلئیک اسیدهای دو رشته ای کوتاه به سیتوزول سلول های هدف وجود دارد. بنابراین، فرمول بندی خاصی با توجه به یک استراتژی مشابه با ژن درمانی مورد نیاز خواهد بود، با این حال هیچ گونه نیازی جهت دسترسی به هسته وجود ندارد. بر این مبنا طرح کارآمد پزشکی را می بایست با توجه به درک این مشکل در سطح مولکولی مدنظر قرار داد. تعامل ما در این مطالعه با هدف کاربرد ژن درمانی غیر ویروسی می باشد و این مطالعه بر روی چنین دیدگاهی تمرکز دارد.

siRNA و فرمول بندی ژن برای ژن درمانی کارآمد

۲- تداخل RNA

۲- ۱٫ تاریخچه و مکانیسم تداخل RNA

siRNA یک RNA دو رشته ای (dsRNA) می باشد که نوعا دارای ۲۱-۲۵ نوکلئوتید در هر رشته می باشد. siRNA به عنوان بخشی از مکانیزم سلولی تحت عنوان RNAi عمل می نماید، که در ابتدا در گلهای اطلسی (Petunia hybrida) مشخص شده و معرف کاهش تجمع رنگدانه ها با توجه به ایجاد ژن های برونزاد است و وظیفه اصلی آن افزایش میزان رنگدانه ها می باشد {۲، ۳}. هدف از آزمایشات انجام شده در این مطالعه افزایش میزان تجمع رنگدانه های گلهای اطلسی از طریق به کارگیری ترکیبات ژنی اضافه می باشد که بیان کننده هر یک از ویژگیهای سنتاز کالکن {۲، ۳} یا دی هایدروفلانوال–۴-رداکتاز می باشد {۲}. با این وجود، گیاهان حاصل آمده دارای گلهای کاملا سفیدی بوده و یا از گلهای دارای بخشهای رنگ پریده بر روی یک زمینه رنگدانه ای برخوردار گردیدند. مکانیزم دقیق این مورد در آن زمان مشخص نشده و به سادگی برای آن عبارت هم- سرکوبی مدنظر قرار گرفت. سطح رونویسی ژن های سنتاز کالکن در گلهای اطلسی به نظر مشابه با ژن های غیر سرکوب شده می باشد و از این رو ویژگی هم سرکوبی می بایست در سطح پسا رو نوشتی باشد {۴}. متعاقبا در سال ۱۹۹۷، سرکوب درون زاد سنتاز کالکن در گلهای اطلسی به نظر در ارتباط با تشکیل ویژگی های جفتی RNA از طریق جفت شدگی بین سلولی توالی های تکمیلی بین توالی کدگذاری کننده و توالی ۳′-UTR تراژن mRNA می باشد {۵}. در حقیقت، تعاملات بدوی که جامعه RNAi گیاهی دارند در ارتباط با این RNAi بازتاب دهنده تحقیقات Hamilton و Sir David C در این زمینه بوده است. در این خصوص فردی به نام Sainsbury در لابراتوار Norwich، UK،

siRNA و فرمول بندی ژن برای ژن درمانی کارآمد

۲-۲٫ ساختار ۲ رشته ای RNA

RNA به عنوان یک پلیمر ریبونوکلئوتید به حساب می آید. هر نوکلئوتید RNA متشکل از یک نوکلئوبیس، پنتوس ریبوز مونوساکارید، و یک گروه فسفات است. نوکلئوبیس ها در RNA شامل آدنین (پورین بیس)، گوآنین (پورین بیس)، اوراسیل (پیریمیدین بیس) و سیتوزین (پیریمیدین بیس) می باشند (شکل ۲). یک نوکلئوزید به هنگامی تشکیل می شود که هر بیس از طریق پیوند گلیکوزیدی به کربن یک آنومری ریبوز متصل می شود، بنابراین به هنگام اعمال فرآیند مرتبط با این ویژگی ها تمامی آنها دربردارنده نوکلئوزیدهای مربوطه خواهند بود. هر دو نوکلئوزیدها از طریق پیوند دی استر فوسفات بین ۳’ نوکلئوزید و ۵’ نوکلئوزید بعدی جهت تشکیل رشته پلی نوکلئوتید RNA به یکدیگر متصل می شوند. تفاوت های اصلی در ساختار عمده RNA و DNA به این صورت مشخص می شود که پنتوز RNA به صورت ریبوز بوده در حالی که پنتوز DNA به صورت ۲’– دی اکسیریبوز می باشد و RNA به جای تیمین دارای نوکلئوبیس اوراسیل است.

۲-۳ پتانسیل درمانی مرتبط با درمانهای RNAi بنیان

دمان RNAi– مبنا در دوره کشف آن به سال ۱۹۹۸ در گیاهان ارائه شده و به عنوان کاندید درمانی قابل توجهی جهت مداوای انواع مختلف بیماریها مدنظر بوده و محدوده وسیعی از مشکلات شامل ادمای ماهیچه ای مرتبط با سن (ورم ماهیچه ای) تا آلودگی های تنفسی و انواع مختلف سرطان ها را شامل می شود {۳۴-۳۶}. علاوه بر درمانهای siRNA – بنیان، shRNA {37،۳۸} و miRNA {39} نیز به عنوان ابزارهای درمانی بالقوه مدنظر هستند. درمانهای siRNA– بنیان قبلا در فاز ۱ و فاز ۲ ویژگی های بالینی قرار داشته و مثال های مربوط به شاخص های آزمایه های بالینی شامل siRNA در جدول ۱ نشان داده شده اند. مفهوم اصلی کاهش یا ممانعت از بیان پروتئینی می باشد که شامل مسیر فیزیولوژیکی بیماری شناسی بیماری های هدف (فرونشانی و سرکوب ژن هدف) است. این مفهوم از کاربرد Cand5 siRNA با هدف قراردهی mRNA و قابلیت ترجمه عامل رشد اندوتلیال عروقی (VEGF) سرچشمه می گیرد، بنابراین سبب کاهش یا بازدارندگی فرآیند رگ زایی و ممانعت از پیشرفت تورم های ماهیچه ای مربوط به سن می شود (جدول ۱) {۴۰}. Atu027  siRNA اقدام به هدف قرار دادن بیوسنتز کیناز پروتئین N3 می شود که نقش مهمی در متاستاز یا فراگستری سرطان دارد {۴۱}.

siRNA و فرمول بندی ژن برای ژن درمانی کارآمد

۳- استراتژی هایی جهت حصول انتقال siRNA و فرونشانی کارآمد ژن

۳-۱٫ تغییرات siRNA

تغییرات siRNA شامل موارد انجام شده در پسمانده ریبوز، در بک بون فسفات در نوکلئوتیدهای RNA، ترمینی siRNA، و / یا از طریق پیوستگی مولکول های دیگر به مولکول siRNA می باشد. این تغییرات در ارتباط با ریبوز در موقعیت – ۲ به صورت شایع بوده {۴۸}، و شامل ۲’-O-alkylation (همانند۲’-O-methyl  و ۲’-O-methylethoxy) می باشد. RNA 2’-Fluoro جزء دیگر موارد اصلاحی می باشد. نوکلئیک اسیدهای قفل شده (LNAs) دارای یک اتصال پلمتیلین ۲’-O به واحد ریبوز ۴’-C بوده که سبب قفل شدگی قند در ساختار ۳’-endo می شود. این موارد اصلاحی منجر به مقاومت افزایشی ریبونوکلئاز می گردد {۴۸، ۴۹}. اصلاحات مرتبط با بک بون فسفات شامل phosphorthioate، boranophosphate و پیوندهای methylphosphonate {48، ۴۹} بوده که برحسب گزارشات سبب افزایش ثبات siRNA در برابر ریبونوکلئازها و phophodiesterases می شود {۵۰}. نوکلئوتیدهای siRNA را می توان با نوکلئوتیدهای DNA جایگزین نمود تا بدین وسیله قابلیت افزایش ثبات و / یا کاهش تاثیرات ناخواسته siRNA حاصل شود {۵۱}. اصلاح های ۳’-overhangs (غالبا ۲ نوکلئوتید به صورت طولی) شامل دی اکسی ریبونوکلئوتیدها جهت کاهش هزینه ها و افزایش ثبات در ۳- اکسوریبونوکلئازها می شوند. فسفوریلاسیون شیمیایی ۵- ترمیناس رشته آنتی سنس منجر به کارآیی فرونشانی بیشتر ژنی می شود، در حالی که دوپلکس های انتها کور به نظر دارای مقاومت بیشتری در برابر اگزونوکلئازها می باشند. مزیت هر کدام از این تکنیک ها، با توجه به استراتژی های اصلاحی دیگر، همراه با ملاحظات مرتبط با میزان اصلاح و تاثیر آن بر روی کارایی فرونشانی ژن و تاثیرات سیتوتاکسیک مرتبط به طور کامل مورد بررسی قرار گرفته اند {۴۸، ۵۲-۵۴}.

۳-۲٫ ناقلهای ویروسی برای تحویل shRNA

ناقلها برای درمان های مبتنی بر RNAi به صورت ناقلهای ویروسی یا غیر ویروسی می باشند. ناقلهای ویروسی (جدول ۲) جهت تحویل ژن های رمز گذاری شده هیرپین با ساختارهای RNA نظیر shRNA و miRNA بکار گرفته می شوند و متعاقبا بر مبنای ویژگی های ماشینی RNAi سلولی برای فرونشانی عملی dsRNA مورد پردازش قرار می گیرند{۶۵، ۶۶}.

ناقلهای ویروسی دو مزیت اصلی را ارائه می دهند، اولین مزیت کارایی بسیار بالا در مقایسه با ناقلهای غیرویروسی می باشد{۶۸}، که ممکن است به میزان اندکی از نقطه نظر بزرگی فراتر از مورد ناقلهای غیر ویروسی باشند و مورد دوم پتانسیل بیان دراز مدت ویژگی های درمانی RNAi تحویلی است که برای درمان بیماری های مزمن نظیر آلودگی  HIVو هپاتیت های ویروسی بسیار مفید می باشد{۶۹، ۷۰}. رترو ویروس ها به عنوان ویروس های RNA  تک رشته پوشش دار به حساب آمده و از یک ظرفیت ژنوم ۷-۱۰ کیلوبازی (kb) برخوردار می باشند. آنها به صورت ترجیحی اقدام به هدف قراردهی سلول های تقسیم شونده ای می نمایند که کاربرد آنها را محدود به بافت های میتوزی می سازد (بنابراین به طور مثال سبب مستثنی شدگی مغز و یاخته های عصبی می شود). رترو ویروس ها با استفاده از آنزیم انتگراز اقدام به یکپارچه سازی DNA خود در ژنوم میزبان می نمایند، که فراهم آورنده بیان دراز مدت ثابت تراژن تحویلی در سلول میزبان و نوادگان آن می باشد. با این وجود، با یکپارچه سازی توالی DNA جدید به داخل ژنوم میزبان می توان سبب افزایش ریسک جهش زایی دخولی شد{۶۸، ۷۱}. کاست بیانی shRNA تحویل شده به وسیله یک ناقل در موش ها جهت فرونشانی یک آنکوژن RAS به منظور سرکوب رشد تومور بکار گرفته شد{۷۲}. ویروس هرپس به طور موفقیت آمیزی جهت تحویل shRNA با قابلیت هدف قرار دهی β-galactosidase بیرونی یا mRNA ژن TRPV1 درونی در نرون های پیرامونی در موش از طریق تزریق مستقیم به داخل عصب سیاتیک حیوانات به کار گرفته شد{۷۳}.

تحقیق جاری در زمینه ناقل های ویروسی برای ژن تراپی بر روی رویکردهایی نظیر مهندسی ناقل همانند اصلاح کپسید ویروسی یا سودوتایپینگ پوششی تمرکز دارند، که شامل استراتژی های تحویل مختلف و مدیریت مناطق دارای امتیازهای مشخص ایمنی می باشد که قابلیت تحمل ناقل های ویروسی تحویلی بدون نشان دادن واکنش از طریق یک پاسخ تورمی را خواهند داشت {۸۰، ۸۵}. یک تحقیق بر روی فرآیند بالا بردن مقیاس تولید ناقل و افزایش کارایی بسته بندی ناقل ها انجام شد{۸۵}، فرآیندی که بدون در نظرگیری آن گسترش موفق کاربرد درمانی ناقل های ویروسی بسیار مشکل خواهد بود.

۳-۳٫ ناقلهای ضد ویروسی

ناقلهای ضد ویروسی برای ژن و تحویل siRNA به عنوان موارد جایگزین برای ناقلهای ویروسی به شمار می آیند، چرا که آنها دارای معایب ناقلهای ویروسی نمی باشند، مخصوصا امیونوجنسیتی و توموجنسیتی را می توان جزء دو موردی تلقی نمود که این ناقلها سبب بروز آنها نخواهند شد. ناقلهای ضد ویروسی را می توان به طور کلی به پپتیدها، ناقلهای پلیمری، ناقلهای کربوهیدرات و ناقلهای لیپید تقسیم نمود {۸۶}. CPPs، را می توان تحت عنوان محدوده های ترارسانی پپتید (PTDs) به حساب آورد، که همچنین دارای قابلیت عبور از غشای سلولی علیرغم وزن و اندازه نسبتا بالای مولکولی خود می باشد (جدول ۳).

PTDها غالبا جزء پپتیدهای دو سطحی کوتاه و/ یا پپتیدهای کاتیونی به شمار می آیند که قابلیت انتقال بسیاری از مولکول های آبدوست در امتداد غشای سلولی را دارند. محدوده گسترده ای از مولکول ها شامل لیپوزوم ها {۸۷، ۸۸}، پپتیدها، پروتئین ها {۸۹}، اسیدهای نوکلئاز پپتید {۹۰} و پولی نوکلئوتیدها{۹۱} از طریق میان سلولی با استفاده از PTDs انتقال یافته و علاوه بر این در محیط طبیعی نیز قابل اعمال می باشند {۵۹،۹۲،۹۳}.

siRNA و فرمول بندی ژن برای ژن درمانی کارآمد

۴- لیپیدهای کاتیونی به عنوان ناقل های ضدویروسی برای تحویل siRNA و DNA

۴-۱٫ ژن رسانی به وسیله لیپیدهای کاتیونی

ژن رسانی (تراآلودگی DNA) با لیپیدهای کاتیونی (شکل ۷) به سال ۱۹۸۷ برمیگردد که در آن دوره به وسیله Felgner و همکاران گزارش شده {۱۳۱}، و عبارت “لیپوفکشن” اختراع گردید. لیپوزوم های تک لایه کوچک حاوی لیپید کاتیونی N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethyl ammonium chloride (DOTMA)  بر مبنای گزارشات قابلیت کمپلکس همزمان DNA با به تله اندازی کامل DNA و هم جوشی ارتقا یافته با غشای سلولی در محیط آزمایشگاهی در ظروف تحت کشت سلولی را داشته که منجر به تحویل کارامد و بیان DNA تحویلی می شود. لیپوفکشن به میزان ۵ الی ۱۰۰ برابر موثرتر از تکنیک های تراآلودگی به کار گرفته شده متعارف چه با استفاده از کلسیم فسفات یا با DEAE – دکستران (دی اتیلی آمینو اتیل – دکستران)، منوط به خط سلولی استفاده شده، می باشد {۱۳۱}. لیپیدهای کاتیونی دارای حوزه های قطبی و غیر قطبی بوده و بنابراین ذاتا آمفی فیلیک هستند و دارای سه حوزه ساختاری کلی می باشند: (الف) یک سرگروه هیدروفیلی کاتیونی (با بار مثبت). این سرگروه قابلیت حمل یک بار دائما مثبت همانند گروه های چهارتایی آمونیوم را داشته یا قابلیت پروتون دار شدگی در ویژگی فیزیولوژیکی pH 7.4، نظیر گروه های آمین اولیه و ثانویه را خواهد داشت. بر این مبنا یک گروه کاتیونی می تواند در مولکول لیپید وجود داشته باشد (لیپیدهای کاتیونی مونوولنت) یا بیش از یک گروه کاتیونی در مولکول لیپی (لیپیدهای کاتیونی مولتی ولنت). (ب) یک حوزه هیدروفوبیک / آب گریز که به صورت کووالنسی به یک لینک دهنده به  سر گروه کاتیونی  متصل می باشد.  این  حوزه  می تواند در قالب زنجیرهای آلکیل (غالبا ۲ زنجیر) با طول زنجیر متغیر (با حالتهای اکسیداسیون مختلف) یا قابلیت استروئید نظیر کلسترول باشد، (ج) پیوند دهنده بین سرگروه و حوزه هیدروفوبیک {۱۳۲، ۱۳۳}. این پیوند دهنده قابلیت کنترل ویژگی زیست تخریبی لیپید کاتیونی را داشته و این قابلیت تحت شرایط مختلف بر مبنای نوع پیوندهای شیمیایی مدنظر خواهد بود (همانند استر، اتر یا آمید). هر حوزه به گونه ای قابلیت کنترل را دارد که بتوان اقدام به تغییر یک ویژگی خاص لیپید کاتیونی نمود، همانند کاربرد یک گروه عاملی دی سولفید به عنوان یک لینکر یا پیوند دهنده زیست پاسخ پذیر {۱۳۴} که در محیط بین سلولی به وسیله گلوتاتیون/ گلوتاتیون رداکتاز کاهش یافته و سبب ارتقای ویژگی های زیست تخریبی لیپید و کاهش سمیت سلولی آن می شود.

۴-۲٫ سرگروه کاتیونی

عملکرد اصلی سرگروه کاتیونی پیوند الکترواستاتیکی فسفات های پلی نوکلئوتیدهای دارای بار منفی می باشد. کمپلکس های لیپیدهای کاتیونی با پلی نوکلئوتیدها نظیر DNA و siRNA تحت عنوان لیپوپلکس ها خوانده می شوند. این مورد نیازمند وجود یک بار مثبت بر روی سرگروه در بخش فیزیولوژیکی pH 7.4 می باشد بدان معنا که pKa سرگروه به صورت یکسان و حداقلی یک واحد بیشتر از فیزیولوژی pH می باشد. شایع ترین سرگروه های استفاده شده حاوی نیتروژن (همانند آمین ها یا گوآنیدین ها) هستند. با این وجود سرگروه های دیگر، نظیر آرسونیوم و فسفونیوم نیز گزارش شده اند {۱۳۵}. آرسونیوم در مقایسه با آرسنیک (III) از سمیت کمتری برخوردار است و در محیط ارزیابی سمیت سلولی آزمایشگاهی مشخص شده است که آرسونیوم و فسفونیوم به طور قابل تعجبی از سمیت کمتری در مقایسه با گروه آمونیوم  برخوردار می باشند {۱۳۶،۱۳۵}.

۴-۳٫ حوزه هیدروفوبیک / آب گریز

طول، حالت اشباع و نوع زنجیره های هیدروفوبیک متصل شده به لیپیدهای کاتیونی بر روی تراآلودگی آنها تاثیرگذار میباشند {۱۵۴-۱۵۶}. با وجود آنکه این عوامل به طور گسترده ای برای تاثیرات مرتبط بر روی تراآلودگی مورد مطالعه قرار گرفته اند و با وجود آنکه اکثریت این مطالعات تاثیر نوع زنجیره های آلکیل بر روی ویژگی خروجی تراآلودگی را مشخص ساخته اند، تعیین یک ویژگی قطعی در ارتباط با قواعد تشریح کننده بهترین نوع زنجیرهای آلکیل جهت پیوند با سرگروه های قطبی مشکل می باشد. تعامل زنجیرهای آلکیل (و حوزه هیدروفوبیک) با خواص لیپید کاتیونی به طور کلی به عنوان موردی می باشد که مشخص کننده کارایی تراآلودگی لیپید است.

نتایج حاصل آمده با DMRIE (2،۱- دی میریس تیلوکسی پروپیل – ۳ – دی متیل هیدروکسی اتیل – آمونیوم برومید) {۱۵۷}، کانجوگیت های گلوسین بتایین {۱۳۸} با دو گروه آلکیل، آلکیل اسیل کارنیتین استر که دارای زنجیره های با طول C12 الی C18 می باشد {۱۵۸}، کانجوگیت های لاکتیک اسید N,N – گروه دی آلکیل آمین {۱۵۹}، لیپیدهای مرتبط با DOTAP با دو زنجیر آلکیل (C12-C18) متصل به سرگروه از طریق پیوندها اتر {۱۶۰} و لیپیدهای کاتیونی با هیدروکسی اتیل یا دی هیدروکسی پروپیل آمونیوم و زنجیرهای هیدروکربن استری شده و جایگزین های هیدرکسیل {۱۶۱}  نشان دهنده آن هستند که یک مقایسه لیپیدهای کاتیونی که صرفا بر مبنای طول ۲ زنجیر چربی دار اشباع شده است منجر به مشاهدات کارایی تراآلودگی متمایز زنجیرهای C14 درازتر از زنجیرهای C16 و C18 میگردد {۱۳۳،۱۳۲}. این مورد پیشنهاد شد که یک طول زنجیره کوتاه تر سبب تسهیل ترکیب با غشاهای سلولی می شود {۱۳۸} که برای فرار اندوزومی مهم است {۱۶۲}.

۴-۴٫ اتصال دهنده

اتصال دهنده بسته به نوع (بعلاوه خواص) گروه عاملی و طول آن (تعداد اتم های کربن) است. این اتصال دهنده یا لینکر دارای دو عملکرد اصلی است: (الف) پیوند کووالانسى سرگروه قطبی به حوزه هیدروفوبیک، (ب) کنترل قابلیت زیست تخریبی لیپید کاتیونی و / یا ارائه یک ویژگی جدید برای لیپید کاتیونی، همانند واکنش به محیط کاهنده داخل سلولی {۱۳۳، ۱۶۷}. شایع ترین گروه های عاملی اتصال دهنده مورد استفاده عبارتند از: آمید، کاربامات، استر، اتر، اورتور استر و دی سولفید.

هر دوی پیوندهای آمید و استر جزء موارد زیست تخریب پذیر بشمار آمده و بنابراین بعنوان موارد کمتر سمی تر در مقایسه با پیوندهای غیر زیست تخریب پذیر (همانند اترها) محسوب می شوند {۱۶۸}. لیپیدها با یک سرگروه پیریدینیوم (با پالمیتویل ۰:۱۶ دومین های هیدروفوبیک و با پیوندهای استر و آمید) جهت مهیا سازی لیپوزوم ها با DOPE یا کلسترول در نسبت مولار لیپد کاتیونی / لیپید هلپر ۱:۱ بکار گرفته می شوند. در پی تراآلودگی سلول های CHO با لیپوپلکس ها با قابلیت تحویل بیان پلاسمید EGFP، لیپیدهای کاتیونی از اتصال دهنده های آمید بطور معنی داری قابلیت ارتقاء کارایی تراآلودگی در کلیه فرمول بندی های لیپوزومی در مقایسه با همتایان خود که دارای اتصال دهنده استر هستند برخوردار خواهند بود {۱۶۹}. کارایی تراآلودگی بالای لیپیدها با اتصال دهنده آمید به نظر بواسطه دمای فاز –  گذار  پایین تر  آنها می باشد که سبب می شود تا ساختار دو لایه لیپوزوم دارای ثبات بیشتری در رسانه آبی در طی فرآیند تراآلودگی همراه با ذخیره سازی لیپوزوم شود. دمای فاز گذار یک لیپید بعنوان دمایی محسوب می شود که در آن شاهد نوعی تغییر در حالت فیزیکی لیپید از فاز ژل مرتب شده (که در آن زنجیره های هیدروکربن دارای انباشتگی نزدیکی با یکدیگر بوده و بصورت کامل گسترش یافته اند) به فاز بلوری مایع بدون ترتیب (که در آن زنجیره های هیدروکربن بصورت سیال بوده و بصورت تصادفی آرایش یافته اند) می باشیم {۱۶۹}.

siRNA و فرمول بندی ژن برای ژن درمانی کارآمد

۵- نتیجه گیری و راهکارهای آتی

در رویکرد ما، مشتقات متقارن و نامتقارن آسیل پلی آمین (آمین های اسید چرب اسپرمین) {۱۵۲} بعنوان ناقل های غیر ویروسی برای siRNA مورد سنتز، توصیف و ارزیابی قرار گرفتند {۱۶۳، ۱۷۴-۱۷۷}. تحویل بین سلولی siRNA و فرونشانی ژن خاص توالی متعاقب بوسیله تکنیک های سیتومتری جریان (تحلیل FACS) مورد بررسی قرار گرفتند {۱۶۳}. قابلیت کانجوگیت های اسپرمین جهت ایجاد siRNA و تشکیل نانوذرات مورد بررسی قرار گرفته و تاثیر کمپلکس های لیپوپلکس های siRNA بر روی زیست پذیری سلولی ۴۸ ساعت پس از تراآلودگی مورد ارزیابی قرار گرفت. مطالعات SAR ما مشخص کننده ویژگی های موثرترین اسیدهای چرب  برحسب کارایی بالای فرونشانی ژنی و زیست پذیری بالای سلولی می باشد {۱۷۴-۱۷۸}.

در عین آنکه ما این بخش را تکمیل نمودیم، چهار مقاله مورد نظر، که هر کدام از آنها در زمینه ویژگی های مختلف این مقاله می باشد، انتشار یافتند. در این زمینه Langer ، Anderson و همکاران در MIT بر روی ویژگی های تحویل مصون برانگیختگی RLA (isRNA) به گیرنده Toll- مانند (TLR) – سلول های بیان کننده جهت تحریک انواع شاخص های درمانی مشخص شده شامل مصون درمانی ضد ویروسی و بعنوان آدجووانت ها یا مواد محرک واکسن تحقیق نموده اند. نانوذرات لیپیدوئید – isRNA، به هنگام تست بر روی موش، واکنش های IFN-α شدیدی را در پی تزریق زیر پوستی نشان دادند که دارای فعالیت ضد میکروبی قدرتمندی می باشند که سبب سرکوب نسخه ناقل ویروس آنفولانزا و ارتقای پاسخ های میانجی گری شده بوسیله – سلول و پاسخ مزاجی ضد اووالبومین به هنگام استفاده از آن به عنوان مواد محرک واکسن می شود. فرمول بندی های لیپیدوئید، که مخصوصا برای تحویل isRNA به TLRs طراحی شده است دارای ویژگی ممتازی در مقایسه با موارد استفاده شده شایع N-[1-(2,3-dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium   بوده و ممکن است بعنوان ابزارهای جدیدی برای بهره گیری از پاسخ های TLR تحت شرایط آزمایشگاهی و محیط طبیعی به حساب آیند {۱۷۹}. 

این موضوع آشکار است که هر دوی ssRNA جهت فعال سازی سیستم ایمنی و RNAi حاصل آمده بوسیله تحویل siRNA دارای پتانسیل درمانی بالایی می باشند. مانع باقی مانده اصلی، در ارتباط با تحویل انتخابی کارآمد و بالقوه به سلول های هدف هم اکنون مورد بررسی قرار گرفته است. تحویل غیر ویروسی siRNA بعنوان یک ابزار اصلی در علم  ژنومیک  کاربردی  مدرن  امروزی  به شمار می آید. بر این مبنا، فرآیندهای طراحی پزشکی، فرمول بندی داروها، در این مورد siRNA و پلاسمید DNA، بعنوان یک ضروریت الزامی برای حصول ژن درمانی کارآمد به حساب می آیند.