مدل آزمایشگاهی استخوان عروقی: هم افزایی رشد عروقی و تشکیل استخوان

مدل آزمایشگاهی استخوان عروقی: هم افزایی رشد عروقی و تشکیل استخوان – ایران ترجمه – Irantarjomeh

مقالات ترجمه شده آماده گروه پزشکی

مقالات ترجمه شده آماده کل گروه های دانشگاهی

مقالات

مدل آزمایشگاهی استخوان عروقی:  هم افزایی رشد عروقی و تشکیل استخوان

 چکیده

مهندسی بافت فراهم آورنده فرصت های منحصر بفردی برای تولید مجدد بافت های آسیب دیده یا  بافت های معیوب با استفاده از سلولهای به دست آمده از بیوپسیهای بافتی را فراهم می آورد. پیوندهای مهندسی بافت را نیز همچنین می توان به عنوان مدل های کاملا مطلوب جهت بررسی تعاملات سطح سلولی و مولکولی در زمینه فرایندهای رشد مورد استفاده قرار داد. در این مطالعه، ما اقدام به هم کشتی سلولهای اندوتلیال وریدی نافی انسانی (HUVECs) و سلولهای پایه مزون شیمی انسان (MSCs) تحت شرایط محیطی مختلف اقدام می نماییم تا آنکه تعاملات هم نیروزادی که منجر به رشد هم بیانی بافت های مویرگ مانند و استخوان مانند را مورد بررسی قرار دهیم. سلول ها به نسبت ۱:۱ در ژل فیبرین کپسوله   می گردند تا آنکه قابلیت پالایش و بررسی ترکیبات رسانه رشد اندوتلیال (EGM) و رسانه رشد استخوان (OM) وجود داشته باشد. این موضوع مشخص گردید که جهت تشکیل هر دوی بافت ها، امر همکشتی    می بایست در ابتدا دارای EGM باشد و در پی آن میزان ۱:۱ از ترکیب دو نوع رسانه حاوی پروتئین-۲ ریخت ساز استخوانی باشد. مطالعات بعدی HUVECs و MSCs رشد داده شده در اسکفولتها یا  داربست های استخوانی میله ای شکل سلول زدایی شده برای ۶ هفته مشخص کننده تاثیرات ساختار بافت هر دوی گوناگونی های موقتی در زمینه موجودیت عامل رشد و اضافه شدن سلول های تازه می باشد. پیوندهای حاصله در زیر پوست یک موش ایمپلند یا کشت گردید تا آنکه ثبات فنوتیپ یا شکل ظاهری و عملکرد رگهای مهندسی شده مشخص گردد. دو یافته مهم بواسطه این مطالعات پدیدار گردیدند: (۱) رشد عروقی می بایست قبل از پیدایش استخوان حاصل گردد و (۲) اضافه نمودن hMSCs  بیشتر در مرحله القای رشد استخوان سبب ارتقای هر دوی نتایج بافتی خواهد شد، همان گونه که بوسیله کسر حجمی افزایشی استخوان، رسوب استخوانی، مجاورت نزدیک پروتئین های استخوان به شبکه های عروقی و هم دهان گردی یا به هم پیوستن و پیوند شبکه های عروقی با سیستم عروقی میزبان مشاهده شده است.  به طور قابل توجه، این مشاهدات به خوبی با آنچه که برای رشد موضعی یا محلی تشریح شده است مقایسه گردید. ما پیشنهاد می نماییم که سیستم کشت ما قابلیت تقلید ویژگی های مختلف سلول اندوتلیال- برهمکنش های پیش ماده مرتبط با تشکیل استخوان تحت شرایط طبیعی، را خواهد داشت و همچنین    می تواند کارای قابل توجهی به عنوان یک مدل برای مطالعات بر همکنش های سلولی هیدروتیپیک که در تعامل با تشکیل رگهای خونی در مبحث پیدایش استخوان دارد را بیابد.

مدل آزمایشگاهی استخوان عروقی: هم افزایی رشد عروقی و تشکیل استخوان

مقدمه

در استخوان طبیعی، برهمکنش های هم افزایی بین استئوبلاستها یا یاخته های استخوان ساز/ پیش ماده های استئوژنیک یا مرتبط با تشکیل استخوان و سلولهای اندوتلیال سبب رشد هماهنگ بافت سیستم عروقی و بافت مینرالیزه می گردد. در فرایند تشکیل استخوان داخل غشایی در طی رشد استخوان کرانیوفاسیال، این جفت شدگی سلولی منجر به ارتباطات فضایی نزدیکی بین دو بافت در استخوان شکل یافته جدید می گردد، که در آن شبکه عروقی به عنوان یک قالب برای ته نشست شدگی کانی استخوان عمل می نماید. یک هم افزایی بین دو جمعیت سلولی در طی تشکیل استخوان اندوکندرال مشاهده شده است. یک مدل موش مانند جهت نشان دادن این موضوع به کار گرفته شد که به هنگامی که پروتئینHIF-1a  به صورت حداکثری اقدام به فعال سازی استوبلاست ها از طریق تهی سازی یا حذف شرطی ژن Vhl   می نماید، نتیجه حالت بالاتر عروقی در استخوان های دراز با افزایش تکمیلی در حجم استخوان می باشد. در مطالعه اخیر، این موضوع نشان داده شد که پیش ماده های استئوبلاست به هنگام اشغال قالب غضروفی در امتداد رگهای خونی اقدام به اشغال موقعیت های پریستیک می نمایند تا آنکه قابلیت تشکیل استخوان جدید میله میله مانند در طی فاز تشکیل استخوان های بزرگ را داشته باشند. با این حال، بسیاری از مکانیزم های برهم کنش های راهنما بین سلولهای اندوتلیال و پیش ماده های استوژنیک به میزان زیادی به واسطه پیچیدگی محیط طبیعی همچنان ناشناخته باقی مانده اند.

مدل آزمایشگاهی استخوان عروقی: هم افزایی رشد عروقی و تشکیل استخوان

مواد و روش ها

مواد

سرم جنینی شبه گاوی (FBS)، روش کشت Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)، پنسیلین – آنتی بیوتیکی (Pen–Strep)، HEPES و تریپسین/ EDTA از Invitrogen (Carlsbad, CA) حاصل آمد. از کوربیک اسید- ۲- فسفات، دکسامتازون، سدیم- b– گلیسروفسفات، تریون X-100، فیبرونوژن و ترومبین از Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) حاصل شد. عامل رشد اولیه فیبربلاست (bFGF) و پروتئین ۲ ریخت زای استخوانی (BMP2) نیز از Peprotech (Rocky Hill, NJ) به دست آمد. رسانه -۲ رشد اندوتلیال (EGM) نیز از Lonza (Walkersville, MD) حاصل شد. محلول نمکی بافری  فسفاتی (PBS) و پروتئیناز K از شرکت Fisher Scientific (Pittsburgh, PA) به دست آمد. کلیه مواد دیگر جزء رتبه های تحلیلی و دارویی از شرکت Sigma–Aldrich حاصل شد.

سلول های پایه مزون شیمی انسانی (MSCs )

سلول های پایه مزون شیمی انسانی حاصل آمده از مغز استخوان (MSCS ) از کسر تک هسته ای مغز استخوان حلقی (Cambrex, CA)، بر مبنای اتصال به پلاستیک های کشت بافت جدا شده کندروژنیک و فینوتیپهای آدیوپوژنیک در محیط مصنوعی و همچنین به واسطه قابلیت های آنها جهت افزایش تشکیل استخوان در محیط آزمایشگاهی و همچنین در محیط طبیعی توصیف می شوند. سه سری از آزمایشات مستقل اجرا شدند که هر کدام با نمونه های سه نسخه ای برای هر گروه آزمایشی، نقطه داده و روش تحلیلی مشخص شدند.

سلول های اندوتلیال وریدی نافی انسانی (HUVECs)

رگهای نافی تازه از بخش کودکان تازه متولد شده در دانشگاه کلمبیا پس از کسب مجوز بر مبنای پورتکل IRB (RBAAAC4839) تهیه شدند. جهت ایزوله سازی HUVECs، این رگ با استفاده بافر HEPES جهت حذف خون پسمانده شسته شده و سپس برای مدت ۱۵ دقیقه جهت حذف سلول های اندوتلیال با تریپسین تحت فراوری قرار گرفت. سلول ها از رگ با HEPES شسته شده و در لوله های سانتریفوژ جمع آوری گردیدند. تعلیق در g300 برای مدت ۵ دقیقه تحت سانتریفوژ قرار گرفته و مواد شناور حذف گردید.    سلول ها مجددا در EGM تحت فرایند تعلیق مجدد قرار گرفته و در فلاسکهای کشت بافت تحت کشت قرار داده شدند. سلول های غیر چسبنده پس از یک روز شسته شدند. به هنگامی که HUVECs  به صورت همشار رشد یافت، آنها تحت فرایندهای تریپیسین، شمارش و کرایوپیزرو یا نگهداری در دمای کاملا پایین قرار گرفتند.

 مطالعات غربالگری رسانه

در این بررسی، HUVECs  در EGM به سمت چهارمین مسیر گسترش داده شد. HUVECs  که در مطالعات غربالگری اولیه استفاده شده بود در رسانه عاری از سرم در ۱۰^۶ × ۱ cells/mL به حالت تعلیق در آمده و سپس در ۱۰ ml/mL مرتبط با Vybrant DiI (میله های ملکولی) برای ۳۰ دقیقه در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد آنکوبه گردید. سلولها برای زدودن رنگ اضافه به مدت سه بار قبل از ترکیب با hMSCs  شسته شدند، که این ترکیب به نسبت ۱:۱ انجام گردیده و در هیدروژل فیبرین در حفره های یک پلیت یا ظرف ۹۶ حفره ای آزمایشگاهی کپسوله گردیده و برای ۶ هفته در محیط آزمایشگاهی کشت شد. یک نسبت ۱:۱ در مطالعات پیلوت (که البته داده ها نشان داده نشده اند) انتخاب گردیده و فراهم آورنده شبکه های قدرتمند و ثابت وریدی بوده اند در حالیکه قابلیت تشکیل استخوان نیز وجود داشته است. هیدروژلها نیز به پنج گروه بر حسب رسانه های رشد مختلف تقسیم شدند. این موارد شامل رسانه استخوان ساز (OM) شامل DMEM دارای گلوکز اندک، ۱۰% FBS، ۱% Pen–Strep همراه با فاکتورهای استخوان ساز:    ۱۰۰ nM دگزامتازون، ۱۰ mM سدیم- b– گلیسروفسفات و ۵۰ mg/mL اسکوربیک اسید-۲- فسفات می باشد. دیگر گروه ها فراهم آورنده EGM یا یک کاکتیل OM و EGM در یک نسبت ۱:۱ می باشند. دامنه موقتی به وسیله فراهم آوردن سلول های EGM تنها برای دو هفته در پی کاکتیل برای دو هفته متعاقب یا رسانای کاکتیل با حالت مکمله با ۱۰ ng/ml BMP-2 مورد بررسی قرار گرفتند. رشد ساختارهای وریدی نیز با استفاده از یک میکروسکوپ هم کانونی  Zeiss510 و با بهره گیری از یک تصویر با ضخامت ۲۰۰ میکرومتر با فضای ۱۰ میکرومتر بین اسلاید ها تصویر برداری گردید.

مدل آزمایشگاهی استخوان عروقی: هم افزایی رشد عروقی و تشکیل استخوان

چارچوب های استخوانی سلول زدایی شده

پلاک های استخوانی (با قطر ۴ میلیمتر ضرب در بلندی ۲ میلیمتر) همانند مطالعه قبلی ما فراهم شد. به طور اختصار، استخوان میله مانند در ناحیه سابکندورال  مربوط به اتصالات کارپومتاکارپال گوساله ۲  هفته ای الی ۴ ماهه، قرار گرفته و سپس با جریان سرعت بالای آب شسته شده تا آنکه مغز استخوان از منافذ آن شسته گردد و پس از آن به صورت ترتیبی در PBS، بافر هیپوتنیک، مواد شوینده و محلول آنزیمی جهت حذف مواد سلولی باقیمانده شسته شد. در انتهای این فرایند، پلاکهای سلول زدایی شده استخوانی به صورت مکرر در PBS شسته شدند و سپس با فرز نمودن خشک گردیده و به بخش های چارچوب مانند برای کشت سلولی بریده شدند. وزن خشک و طول دقیق هر پلاک اندازه گیری شد و جهت محاسبه دانسیته و میزان تخلخل این چارچوب محاسبه گردید. چارچوب ها در ابتدا در اتانول ۷۰ درصد برای یک روز استریل شده و در رسانه کشت یا در ظرف کشت در خلال یک شب قبل از پرورش سلولی آنکوبه گردیدند.

آنکوبه سازی سلولی و پرورش آن

جهت تهییج تشکیل استخوان، تعلیق۲۰ ml مرتبط با MSCs  در یک چگالی ۱۰^۶ × ۱۰ cells/mL به چارچوب های بلات – خشک پرورش یافته و به پنج گروه تقسیم شدند و در خلال شب آنکوبه گردیده تا آنکه اتصال سلولی همان گونه که در شکل ۱ نشان داده شده است محقق شود. در روز اول، محلول های فیبروفیبرینوژن (۵ mg/mL) و ترومبین (۱۰ Units/mL) مهیا گردیدند. در گروه های ۱ الی ۴، HUVECs  و MSCs  که می بایست شبکه وریدی ثابت را تشکیل دهند، در فیبرین به نسبت ۲:۱ و چگالی ۱۰^۶ × ۳۰ cells/mL کپسوله شدند. ترموبین جهت پیوند متقاطع ژل اضافه گردید تا آنکه غلظت نهایی فیبرین به میزان ۴ mg/mL حاصل شود. قبل از این پیوند متقاطع، ۲۰ ml از سوسپانسیون سلول/ ژل در چارچوب های بلات- خشک به وسیله پیپت ؟/ اندازه گیری شده تا آنکه قابلیت کشت یکنواخت سلولی در چارچوب ها فراهم گردد. قبل از آنکه ژل ها به صورت کامل دارای پیوند عرضی گردند، آنها تحت یک واکیوم سبک تحت خلأ قرار گرفتند به گونه ای که ژل فیبرین جداره های این چارچوب ها را تحت پوشش قرار داد، اما فضاهای منفذ را پر ننمود. در گروه ۵، مرحله مشابهی بر روی چارچوب های کشت MSC پس از چهار هفته کشت استخوانی اعمال گردید.

کشت در محیط آزمایشگاهی

پنج گروه آزمایشی جهت بررسی ساختارهای استخوانی عروقی شده شامل سه گروه اصلی و دو گروه شاهد آماده شدند (شکل ۱). گروه ۱ (جهت کنترل شرایط پیدایش استخوان) از رسانه استخوان ساز ((OM) در خلال کشت استفاده نمود که حاول گلوکز پایین (OM، ۱% FBS، ۱% Pen–Strep تکمیل شده به وسیله فاکتورهای استخوان ساز: ۱۰۰ nM دگزامتازون، ۱۰ mM سدیم- b– گلیسروفسفات، و ۵۰ mg/mL اسکوربیک اسید-۲ – فسفات، تکمیل شده با BMP-2 (در ۱۰ ng/mL) برای مدت ۶ هفته استفاده شدند. گروه ۲ (جهت کنترل شرایط عروقی ژنی) از رسانه رشد اندوتلیال در طی این کشت استفاده نمود.       گروه ۳ نیز از EGM برای ۲ هفته استفاده نموده و سپس یک رسانه کوکتل متشکل از EGM و OM با نسبت ۱:۱ (EGM|cocktail) برای چهار هفته مورد استفاده قرار گرفت. گروه ۴ دقیقا همانند گروه ۳ طراحی شده بودند به استثنای آنکه MSCS  شامل – استخوان نیز در فضاهای منفذ چارچوب به مدت زمانی ۲ هفته اضافه شده بود (EGM|cocktail+MSC). در گروه ۵، MSCs  تنها در داخل داربست ها کشت شده و نهایتا در رسانه استخوان ساز برای ۴ هفته مورد کشت قرار گرفت که در آن نقطه HUVECs  و MSCS  در فیبرین به این مجموعه اضافه شده و در رسانه کوکتل برای ۲ هفته اضافه کشت گردیدند (OM|cocktail).

کشت در محیط طبیعی

پس از ۶ هفته کشت در محیط مصنوعی، کلیه عناصر این گروه ها برای مدت ۲ هفته در زیر پوست موش در محیط طبیعی مورد ارزیابی قرار گرفتند. موش NOD SCID                                    (NOD.CB17-Prkdc^scid/NCrHsd, Harlan) به وسیله تزریق کتامین (۱۰۰-۸۰ mg/kg) و زیالازینگ (۱۰-۵ mg/kg) بیهوش شد. این بیهوشی با استفاده از بوپرنورفین (۱/۰-۰۵/۰ mg/kg) حاصل آمد. اجزای مربوطه در بخش های مجزای بخش پشتی زیر پوستی موش کشت شد (هر بخش در یک پاکت، دو پاکت برای هر حیوان) که بر مبنای رویه پذیرفته شده کمیته بین المللی مراقبت و استفاده از حیوانات دانشگاه کالیفرنیا (IACUC) انجام گرفت. موارد ایمپلنت شده پس از ۲ هفته برای آنالیز پیوند ورید خونی و رشد استخوان از بدن موش ها خارج شد.

سنجش DNA

بخش های مختلف این ساختار در PBS شسته شده و سپس به دو نیم تقسیم گردیده و در داخل لوله های میکوسانتیفوژ قرار گرفته و در طول شب در دمای ۵۶ درجه سانتیگراد در بافر هضم ۱/۰ mg/mL  (۱۰ mM Tris، ۱ mM EDTA و-۱۰۰  Triton X 1%) حاوی پروتوئیناز K آنکوبه گردید. بخش های شناور جمع آوری شده و به میزان ده برابر رقیق گردیده تا آنکه یک محدوده خطی برآورد پیکوگرین حاصل شود. یک منحنی استاندارد از محلول باکتریوفاز DNA l از میله های مولکولی به دست آمد. رنگ پیکوگرین (میله های مولکولی OR) در ظروف ۹۶ حفره ای نمونه ها اضافه گردید (رنگ ۱۰۰mL ) و به وسیله سیستم فلوروسنت ؟؟ (با درجه برانگیختگی ۴۸۵nm ، انتشار ۵۲۸ nm) خوانده شد.

بررسی حالت زنده- مرده

بخش های مختلف به دو قسمت تقسیم شده و در PBS شسته گردیده و در کلسین AM آنکوبه شد (که معرف سلول های زنده می باشد) و این عمل برای اتیدیوم هومودیامر- ۱ ( که معرف سلول های مرده است) نیز بر حسب پروتکل شرکت سازنده انجام گردید (LIVE/DEAD (R) Viability/Cytotoxicity Kit، Molecular Probes) و نهایتا با استفاده از یک میکروسکوپ هم کانون تصویر برداری شد. اسلایدهای نوری از ۱۰۰ در فواصل ۱۰ میکرون تا عمق ۱۶۰ میکرومتر حاصل گردیده و به عنوان یک نمای عمودی ارائه شد.

ایمونوهیستوشیمی

اجزای مختلف پس از شسته شدن در PBS و تثبیت شدگی در ۱۰ درصد فرمالین برای مدت دو روز با محلول امیونوکال کلسیم زدایی شده و اتانول رتبه بندی شده آب زدایی گردیدند و سپس در پارافین به میزان ۵ میکرون قرار گرفته و بر روی اسلایدهای شیشه ای نصب شدند. این بخش ها سپس با استفاده از سیتریسولو پارافین زدایی گردیده و با استفاده از مواد شوینده اتانول مجددا آبدهی گردیده و با سرم معمولی بلوکه شده و با بهره گیری از پاتتن های اولیه و پس از آن پاتتن ثانویه لکله گیری شده و با سیستم بیوتین / آویدین رشد داده شدند.

مدل آزمایشگاهی استخوان عروقی: هم افزایی رشد عروقی و تشکیل استخوان

 رادیولوژی ریزکامپیوتری (mCT)

mCT بر روی کلیه ۵ گروه مشخص شده پس از ۶ هفته کشت در محیط آزمایشگاهی اعمال گردید. به عنوان یک شاهد، داربست های کشت نشده در OM باقی ماند که در خلال دوره کشت همچنان ثابت مانده و در این زمان مورد تحلیل قرار گرفت. اصلاح پروتکل توسعه یافته قبلی نیز مورد استفاده قرار گرفت.    نمونه ها در امتداد مسیر محوری هم طراز شده و در یک لوله سانتریفوژ ۲ mL که در داخل نگهدارنده نمونه سیستم vivaCT 40 قفل شده بود به صورت تراز در آمدند (SCANCO Medical AG، Basserdorf، Switzerland). طول ۲ میلیمتری داربست به اندازه وکسل ایزوتروپیک ۲۱ میکرون اسکن شد. حجم کلی استخوان (BV) مسئول مجموع ماتریس استخوانی در این داربست بوده و استخوان مینرالیزه جدید از کاربرد تکنیک آستانه سازی عمومی حاصل آمد به گونه ای که بافت مینرالیزه شده تشخیص داده شد. کسر حجمی استخوان (BV/TV) به عنوان نسبت BV و حجم کلی (TV) نمونه مشخص گردید. رزولوشن فضایی این مدل وکسل کامل برای ارزیابی ریزساختار نمونه ها به میزان کفایت تشخیص داده شد.

ارزیابی پیوند محیط طبیعی و تشکیل استخوان جدید

پس از ۲ هفته ایمپلنت زیرپوستی در موش NOD SCID نمونه ها جمع آوری گردیده و در PBS شسته شده و تصاویر میکروسکوپی با استفاده استریومیکروسکوپ یا میکروسکوپ سه بعدی مورد پردازش قرار گرفتند. نمونه ها نصف شده و برای بافت شناسی نرم و سخت بافت ها به کار گرفته شدند. پیوند محیط آزمایشگاهی قابلیت رشد شبکه های مویرگی با سیستم عروقی میزبان را داشته که این مورد با استفاده از ایمیونوکلازیسیون CD31 انسانی (Millipore 04-1074) که در بالا تشریح شد مورد ارزیابی قرار گرفت.

اطلاعات آماری

آنالیز آماری با استفاده از نرم افزار GraphPad انجام شد. یک آنالیز یک تحلیل واریانس یک طرفه (ANOVA) با استفاده از آزمون مقایسه ای چند گانه توکی انجام پذیرفت تا آنکه تفاوت معنی دار آماری در بین گروه ها مشخص شود. P < 0.05 به صورت معنی دار آماری مشخص گردید. داده ها به عنوان میانگین SD± مشخص شدند.

مدل آزمایشگاهی استخوان عروقی: هم افزایی رشد عروقی و تشکیل استخوان

 نتایج

تشکیل شبکه های عروقی در هیدروژل های فیبرین

ما تایید نمودیم که شبکه های مویرگی تشکیل شده از HUVECs  تنها در حضور MSCs  و در شرایط آزمایشگاهی دارای ثبات می باشند (شکل S1). شبکه های قدرتمند به وسیله میکروسکوپ هم کانون در خلال ۲ هفته کشت در رسانه رشد اندوتلیال مشاهده شد (شکل S2– گروه EGM) و به صورت ثابت در خلال ۶ هفته کشت باقی ماند. به هنگامی که OM به عنوان دوره شروع کشت به کار گرفته شد (شکل S2– گروه OM)، سلولها قابلیت تشکیل شبکه ها را نداشتند. در مقابل، میزان قابل توجهی از پسماندها از HUVECs  به وسیله میکروسکوپ هم کانون مشاهده شد (و به عنوان یک پارامتر ساختگی برای ارزیابی زیست پذیری HUVEC به کار گرفته شد) سلولهای داخل رسانه کوکتل (نسبت ۱:۱ EGM+OM) تشکیل دهنده شبکه های عروقی می باشند، که شواهد آن از طریق تصاویر هم کانون قبل از رنگ نمودن HUVECs مشخص  شده است. با این حال مقدار بالای پسماندهای سلولی مشاهده شدند (شکل S2– گروه کوکتل).

تشکیل شبکه های استخوانی و مویرگی در داربست های کشت شده در محیط آزمایشگاهی

بر مبنای مطالعات غربالگری اجرا شده بر روی ژل فیبرین، ما کلیه رساناهای استخوان ساز را با BMP-2 تقویت نمودیم که علت آن حفظ زیست پذیری جمعیت اندوتلیال بوده است. HUVEC و hMSCs  به صورت یکنواخت در داربست استخوانی سلول زدایی شده کشت گردیده و به صورت شایع بر روی سطوح جداره مشخص شد (شکل S3). میزان DNA این اجزا مشخص کننده آن می باشند که تکثیر سلول ارتقاء یافته به میزان قابل توجهی بیشتر از OM می باشد ((p < 0.05) EGM). این مورد به طور آشکار یک واکنش سلولی مشخص برای عوامل رسانه OM می باشد چرا که EGM|cocktail نیز همچنین دارای سلول های بیشترین در مقایسه با EGM به تنهایی است. بدون تعجب، گروه ۴ (EGM|cocktail+MSC) و گروه ۵ ۰ OM|cocktail) دارای بیشترین سلولها بوده اند (شکل ۲)، که معرف اضافه شدن سلولهای بیشتری بدین ساختارها می باشد. میکروسکوپ هم کانون قابلیت نمایش زیست پذیری سلولی در کلیه   گروه ها را دارا می باشد (سنجش مرده/ زنده) و شبکه های مویرگی قدرتمند در گروه ۳ و ۴ (سنجش …) (شکل ۲).

خواص شبکه های مویرگی در محیط طبیعی

تصاویر میکروسکوپی گرفته شده با استفاده از میکروسکوپ سه بعدی معرف رشد رگهای خونی به صورت قابل توجه در هر یک از بخش ها می باشد (شکل ۵). در برخی از گروه ها، تزریق خون از طریق ساختارهای شبکه ریز عروقی نیز مشاهده شد. تنها مویرگهای اندکی در گروه OM مشاهده شدند، در مقایسه با دانسیته بالاتر عروقی در گروه EGM. گروه های ۳ و ۴ واسکیوژنز قبل از تمایز استخوانی القای گردیده که معرف رشد شبکه های قدرتمند مویرگی می باشند. کلسیم زدایی ساختارها نیز به صورت مشخص نمودن رنگ با CD31 انسانی جهت تصدیق حضور شبکه های عروقی قبل از کشت و عملکرد در محیط طبیعی مشخص گردید.

مدل پیشنهادی رشد استخوان عروقی شده در محیط آزمایشگاهی

در مطالعات اولیه هیدروژل، ما دریافتیم که با فراهم آوردن رسانه استخوان ساز به صورت هم کشت با HUVEs و hMSCs  رویه تقریبی یا زیان آور برای تشکیل سیستم عروقی تشدید خواهد شد. در نتیجه، مطالعات بعدی سعی در توسعه رویه رشد سیستم عروقی قدرتمند از طریق کاربرد EGM برای دو هفته نمودند. مطالعات اولیه نشان داد که ساختارهای موئینه ای مانند یا مویرگی مانند به وسیله HUVECs  در ظرف چند روز شکل یافته و تنها در صورت حضور hMSCs  حالت با ثبات یافته اند. 

مدل آزمایشگاهی استخوان عروقی: هم افزایی رشد عروقی و تشکیل استخوان

مباحث

هدف اصلی این مطالعه بررسی این فرضیه است که کاربرد ترتیبی فاکتورهای رشد، در ابتدا قابلیت القای تشکیل سیستم عروقی ثبات را داشته و سپس قابلیت مشخص نمودن تمایزات اولیه استخوان سازی را نیز خواهد داشت، که خود فراهم آورنده یک روش القای بیولوژیکی در محیط آزمایشگاهی در خصوص     عروقی سازی استخوان می باشد. تا اینجا، ما به صورت سیستماتیک شرایط کشتی را مورد بررسی قرار دادیم که سبب مشخص سازی ساختارهای عروقی اصلی و توانمند سازی استخوان سازی با استفاده از همکشتهای HUVEC-MSC در تعامل با مهندسی بافت توسعه یافته قبلی و روش های بیوواکنشی یا  زیست واکنش پذیر می باشد. ما پیشنهاد می نماییم که سیستم استفاده شده در این بررسی می بایست از یک روش متناسب مهندسی بافت در مبحث استخوان عروقی سازی شده برای مطالعات مکانیکی و تعاملات سلول به سلولی بین سلولهای اندوتلیال و پروجنیستورهای استخوان ساز برخوردار باشد. در حقیقت، مطالعه اخیر نشان دهنده آن است که سلولهای اندوتلیال عروقی ممکن است یک قابلیت ذاتی در زمینه انتقال یا عبور به پروجنیستورهای مزون شیمی را داشته باشد و بنابراین احتمالات قابل توجهی را برای نقش سلولهای اندوتلیال در این  مدل پیش روی ما فراهم می سازد.

در مطالعات آتی، این موضوع نیز مرتبط خواهد بود تا نسبت به مشخص نمودن آنکه آیا HUVECs و MSCs به طور مساوی در این گروه شبیه سازی شده اند اقدام شود و همچنین قابلیت کشف نقش تکثیر سلولی در رشد بافت نیز محرز گردد. به علاوه، علیرغم نتایج نوید دهنده، مطالعه ما این موضوع را مشخص می سازد که کوکتل های جایگزین (نظیر EGM|OM یا فاکتور رشد عروقی فزاینده با تمرکز در گروه OM|cocktail) را می توان به صورت هم نیروزایی جهت ارتقای مینرالیزه شدگی با تشکیل شبکه عروقی مورد ارزیابی قرار داد. همچنین، مطالعات بعدی نیز می بایست جهت بهینه سازی مراحل زمانی کشت انجام پذیرند، چرا که دوره دو هفتگی القای عروقی بر مبنای ساختارهای شبکه قدرتمند مشاهده شده برای مطالعات ژن فیبرین انتخاب شده بود.