تیپ بندی MLST جدایه های آکنه پروپیونیباکتریوم

تیپ بندی MLST جدایه های آکنه پروپیونیباکتریوم – ایران ترجمه – Irantarjomeh

مقالات ترجمه شده آماده گروه پزشکی

مقالات ترجمه شده آماده کل گروه های دانشگاهی

مقالات

تیپ بندی MLST جدایه های آکنه پروپیونیباکتریوم  مقاوم- ضد میکروبی با ستفاده از بیماران دارای سطح متوسط تا شدید آکنه ولگاریس

چکیده

داده های تیپ بندی مولکولی سویه های پروپیونیباکتریوم مقاوم ـ ضد میکروبی به صورت محدودی در این مباحث مورد بحث قرار گرفته اند. در این راستا ما اقدام به بررسی پروفایل های مقاومت ضدمیکروبی و مکانیزم های مقاومت بنیادی در جدایه های پروپیونیباکتریوم SPP از بین بیماران با آکنه ولگاریس در سطح متوسط تا شدید در یونان نموده ایم. ویژگی کلونالیته جدایه های آکنه پروپیونیباکتریوم مقاوم نیز مورد بررسی قرار گرفته است.

جدایه های پروپیونیباکتریوم SPP با استفاده از ظروف آگار تریپتون ـ عصاره مخمر ـ گلوکز (TYG) همراه با ۴% فورازولیدون تشخیص داده شد. اریترومایسین، کلیندامایسین، ونکومایسین، پنی سیلین، کو-تریموکسازول، داکسی سایکلین، مینوسایکلین و سیپروفلوکساسین MICs با استفاده از روش نوار گرادیان مشخص شدند. مکانیزم های اریترومایسین، کلیندامایسین و تتراسایکلین در ارتباط با مقاومت نیز با استفاده از PCR و توالی حوزه V مرتبط با ۲۳S rRNA و ۱۶S rRNA نیز همراه با وجود ژن ermX مشخص شدند. فرایند تیپ بندی با استفاده از تیپ بندی توالی چند لوکوسی (MLST) انجام شد.

۷۹ جدایه از ۷۶ بیمار جمع آوری گردید. ۲۳ جدایه (۱/۲۹% نشان دهنده مقاومت در برابر اریترومایسین و کلیندامایسین بوده اند، در حالی که دو جدایه دیگر (۵/۲%) صرفاً در برابر اریترومایسین مقاومت نشان داده اند. مقاومت در برابر تتراسایکلین تشخیص داده نشد. مکانیزم های مولکولی اصلی جهش های نقطه ای A2059G و A2058G گزارش شدند. تیپ بندی MLST در ارتباط با جدایه های مقاوم آکنه P  مشخص کننده آن می باشد که  نوع  سویه  IA₁ (ST-1، ۳ و ۵۲) فراهم آورنده (۱۸/۱۲، ۷/۶۶%) در نظر گرفته شده، در حالی که نوع سویه IA₂ (ST-2 و ۲۲) مسئول پنج جدایه بیشتر (۸/۲۷%) است. جدایه های مظنون به صورت یکنواخت تری بین تیپ بندی های ST توزیع شده بودند.

پروپیونیباکتریوم SPP از آکنه ولگاریس سطح متوسط تا شدید در یونان به صورت مکرر قابلیت مقاومت در برابر اریترومایسین / کلیندامایسین را داشته اند، اما این موضوع برای تتراسایکلین صحت ندارد، که  علت آن  عمدتاً  به واسطه  جهش های نقطه ای  A2059G  و  A2058G  می باشد. جدایه های مقاوم آکنه ای P، در ارتباط با انوع مستعد، از ویژگی کلونالیته بیشتری برخوردار بوده و متعلق به تعداد محدودی از  تیپ بندی های MLST می باشند.

کلمات کلیدی: آکنه پروپیونیباکتریوم، MLST، اریترومایسین، کلیندامایسین، تتراسایکلین، مقاومت.

تیپ بندی MLST جدایه های آکنه پروپیونیباکتریوم

 ۱- مقدمه

پروپیونیباکتریوم SPP به عنوان یک ژن گرم مثبت آئروتولرنت بی هوازی می باشد، بخشی از ریزجانداران طبیعی که در زیر پوست، حفره های دهانی و بخش های روده ای و همچنین مجاری تناسلی ـ بولی زندگی می کنند [۱]. چنین میکروبی را می توان به عنوان یک پاتوژن یا عامل بیماریزای فرصت طلب دانست که سبب بروز آکنه ولگاریس می شود، در عین حال این میکرب ممکن است سبب بروز محدوده گسترده ای از آلودگی های دیگر نیز شود، شامل آلودگی های ابزارآلات پزشکی و آلودگی های چشمی، باکتریمی و التهاب استخوتنی یا استئومیلیت‌.  به علاوه چنین موردی می تواند در ارتباط با سرطان های سارکوئیدوز و پروستات نیز باشد [۱ ،۲]. شایع ترین گونه ها در ارتباط با ویژگی های روزمره بالینی آکنه پروپیونیباکتریوم می باشد، و پس از آن دیگر انواع پروپیونیباکتریوم گرانولزوم، و پروپیونیباکتریوم آویدوم قرار می گیرند.

عامل بیماریزا بر روی محیط غنی از چربی واحد پیلوسباسه پوست تشکیل کلنی داده و سبب ایجاد فاکتورها یا عوامل کیموتاکتیک و مولکول های پیش التهابی می گردد که خود مسئول فاز تورمی آکنه ولگاریس می باشد، نوعی بیماری فلوکول فیلوسباسه که منجر به زخم های بالینی تورمی و غیرتورمی می شود. این ویژگی های بیماریزای آکنه به صورت چند فاکتوریل مدنظر می باشند، که شامل افزایش سیبوم یا چربی مترشحه، هایپر تکثیر مجاری پوستی، کلنی شدگی آکنه P و تورم خواهد شد [۳، ۴].

مداوای آکنه شامل کاربرد عامل های آنتی بیوتیک و غیرآنتی بیوتیک می باشد. آنتی بیوتیک ها استفاده شده شامل عمدتاً اریترومایسین (Ery) و سلیدامیسین (Cli) از گروه ماکرولید ـ لینکوسامید (ML) می باشند، همراه با گروه تتراسایکلین (TET)، متشکل از تتراسایکلین (Tet)، مینوساکلین (Min)، یا داکسی سایکلین (Dox) [3، ۵، ۶]. مقاومت در غالب مطالعات اپیدمیولوژی تشریح شده است، و علاوه بر این گوناگونی جغرافیایی نیز وجود دارد، مخصوصاً با توجه به گروه TET، که از رتبه ۰ الی ۶۰% در این رابطه گزارش شده است. در مقابل، نرخ مقاومت ML از گوناگونی جغرافیایی کمتری برخوردار می باشد و نرخ گزارش شده در محدوده از ۱۰ الی ۳۰% است [۵، ۷ ـ ۱۰].

در گذشته، تیپ بندی جدایه های آکنه P با استفاده از الکتروفروز ژل میدانی پالس دار شده (PFGE) [10]، تقویت تصادفی پلی مرفیک DNA (RAPD) [11] یا میکروسکپی میکرو ـ امیونوفلورسنس [۱۲] انجام شده است. به علاوه، فرایند یونیزه سازی واجذبی لیزر (MALDI-TOF) در حداقل یک مطالعه دیگر برای تیپ بندی تحلیل فیلوژنتیک یا تکامل نژادی انجام شده است [۱۳]، با این حال چنین تکنیکی عمدتاً برای شناسایی باکتری مدنظر می باشد. با این وجود، در طی سالیان اخیر، تیپ بندی توالی چند لوکسی (MLST) به عنوان یک ابزار قدرتمند جدید ارائه شده است که دارای ویژگی های تمایزی سطح بالا می باشد [۲، ۱۴ – ۱۷]. با این وجود، داده های تیپ بندی MLST در خصوص سویه های مقاوم چندان وجود ندارد، و بنابراین مطالعات مربوطه کاملاً محدود می باشند [۲]. هدف مطالعه جاری بررسی مقاومت بالینی آنتی میکروب های مهم و مکانیزم های مقاومت اصلی جدایه های پروپیونیباکتریوم از بیماران دارای آکنه ولگاریس در سطح متوسط یا شدید در یونان می باشد. ویژگی های آنتی میکروبی مقاومت جدایه های آکنه P با استفاده از روش MLST مورد بررسی قرار گرفته است.

۲- مواد و روش ها

۲ـ۱٫ بیماران و جدایه ها

در طی دوره نوامبر ۲۰۱۰ الی مارس ۲۰۱۱، کلیه بیماران دارای آکنه ولگاریس از سطح متوسط تا شدید بودند، که این مورد در کلنیک سرپایی بیماران پوستی بیمارستان آندراس سیگروس تشخیص داده شد. در این رابطه از آنها درخواست شد تا رضایت خود را جهت مشارکت در این بررسی پس از امضای یک برگه رضایت نوشتاری اعلام نمایند.

ارزیابی شدت آکنه با استفاده از سیستم رتبه بندی و سیستم رده بندی پیشنهادی قبلی صورت پذیرفت [۶]، که به صورت آکنه در سطح ملایم (<20 چربی دانه ، یا <15 جراحت تورمی، یا مجموع جراحت های <30)، آکنه سطح متوسط (چربی دانه های ۲۰۰ ـ ۱۰۰ یا آسیب های تورمی ۱۵ ـ ۵۰، یا مجموع آسیب های ۳۰ ـ ۱۲۵)، یا آکنه شدید (>5 کیست، یا مجموع چربی دانه ها >100، یا مجموع آسیب تورمی >50، یا مجموع آسیب ها >125) مشخص شد.

۲ـ۲٫ آزمون آمادگی و مکانیزم های مقاومت

حداقل غلظت مهارکننده (MICs) برای اریترومایسین، کلیندامایسین، ونکومایسین، پنی سیلین، کوتریموکسازول، داکسی سایکلین، مینوسایکلین و سیپروفلوکساسین با استفاده از روش نوار گرادیان و نوارهای آزمایش MIC مشخص شد (Liofilchem, 64026, Italy)، که بر مبنای دستورالعمل های تولید کننده مشخص گردیده است، آن هم با توجه به کاربرد ظروف آگار بوروسلا با ۵% v/v خون گوسفند، ویتامین K1 (1 mg/L) و هیمن (۵ mg/L) (زیست آماده). فرایند آنکوبه سازی ظروف تحت شرایط ناهوازی در ۳۷ درجه سلسیوس برای ۴۸ ساعت انجام شد. تفسیر نتایج نیز بر اساس آزمایش آمادگی ضد میکروبی کمیته اروپا (EUCAST) با توجه به دستورالعمل های ارائه شده در مستندات v4.0 اعمال گردید [در دسترس بر روی وب سایت ذیل است:

شرایط ناهوازی نیز با نوارهای آبی متیلین و رزازورین مورد آزمایش قرار گرفتند. سویه های باکترئیدهای فراژیلیس ATCC 25285 و باکترئیدس تتاآیوتائومیکرون ATCC 29741 برای کنترل کیفیت آزمایش آمادگی بکار گرفته شد.

اریترومایسین (Ery)، کلیندامایسین (Cli)، و تتراسایکلین (Tet) از نقطه نظر مکانیزم های مقاومت در کلیه جدایه های مقاوم با استفاده از PCR و روش توالی ژن ها با توجه به حوزه کدگذاری V در ارتباط با ۲۳۵ rRNA برای Ery و Cli و همچنین ۱۶S rRNA برای سویه های مقاوم Tet، همراه با وجود ژن ermX، بر مبنای پروتکل های مشخص شده قبلی، مورد بررسی قرار گرفتند [۷].

۲ـ۳٫ تیپ بندی MLST

تیپ بندی MLST [2، ۱۷] بر روی کلیه جدایه های آکنه مقاوم P انجام گرفته و همچنین بر روی کلیه افراد مستعد مجددی که در یک زمان از این عارضه رهایی یافته بودند نیز این عملیات بر مبنای روش و رهنمود ارائه شده در وب سایت PubMLST به آدرس (http://pubmlst.org/pacnes/,http://pubmlst.org/pacnes/، ۱۵ اکتبر ۲۰۱۴) انجام شد. PCR در ۵۰ ml حجم نهایی با استفاده از ترکیب GoTaq Hot Start Colorless Master Mix نیز در نظر گرفته شد (Promega Corp., Madison, WI, 53711, USA)، و علاوه بر این از ترموسایکلر MyCycler نیز استفاده شد.

۲ـ۴٫ تحلیل آماری

تحلیل آماری با استفاده از روش مربع کای انجام شد. اهمیت آماری به میزان <0.05 به دست آمد.

۲ـ۵٫ موافقت اخلاقی

این مطالعه بر مبنای موافقت کمیته اخلاقیات کالج پزشکی دانشگاه ملی آتن صورت گرفته است (به شماره ۷/۳۰-۰۷-۰۹) .

تیپ بندی MLST جدایه های آکنه پروپیونیباکتریوم

۳- نتایج

۳ـ۱٫ بیماران و جدایه ها

در طی دوره این مطالعه مجموع ۷۶ بیمار، که دارای آکنه ولگاریس در حد متوسط یا شدید بوده اند، بر مبنای دسته بندی مشخص شده فوق [۶]، به منظور شرکت در این مطالعه رضایت خود را اعلام داشتند. کلیه ۷۶ بیمار، پس از جمع آوری نمونه ها، تحت درمان قرار گرفتند که شامل رژیم ضدمیکروبی بوده است.

کشت مثبت از ۶۴ بیمار (۲/۸۴%) گرفته شد و مجموع ۷۹ جدایه پروپیونیباکتریوم SPP حاصل شد. مشخصه نمونه ها این موضوع را آشکار ساخت که آکنه P به عنوان یک عارضه وجود دارد (۷۹/۶۵، ۳/۸۲%) و پس از آن موارد دیگری نظیر P. granulosum (79/8، ۱/۱۰%)، P. avidum (79/5، ۳/۶%) و Propionibacterium freudenreichii (79/1، ۳/۱%) نیز دیده شده اند. یک سویه واحد در ۴۹ بیمار به صورت جدایه مشخص گردیده در حالی که دو سویه متعلق به گونه های مختلف نیز در ۹ بیمار مشخص گردیدند (P. acnes/P. granulosum، P. acnes/P. avidum، P. acnes/P. freudenreichii و P. granulosum/P. avidumcombination، در پنج، دو، یک و یک بیمار به ترتیب). به علاوه، دو سویه مختلف متعلق به گونه های یکسان نیز در شش بیمار تعیین شد (کلیه آنها به صورت آکنه P گزارش شدند، تفاوت بر مبنای الگوهای آمادگی یا استعداد بیماران مشخص شد، این الگو به صورت مقاوم / مستعد یا مستعد / مستعد مشخص گردید، اما با حداقل سه ویژگی محلول مختلف در حداقل یک آنتی بیوتیک مورد آزمایش قرار گرفته).

۳ـ۲٫ آزمایش آمادگی

کلیه جدایه ها حساس به پنی سیلین، ونکومایسین، سیپروفلوکساسین و مینوسایکلین بوده اند. مقاومت در برابر هر کدام از اریترومایسین و / یا کلیندامایسین (ML) در ۲۵ مورد از ۷۹ جدایه مشخص شد (۶/۳۱%) که از این بین ۲۳ جدایه (۱۶، ۴ و ۳ مورد مشخص شده به عنوان آکنه P، P. granulosum و P. avidum به ترتیب) در برابر هر دوی آنتی میکروب ها و ۲ (هر دو آکنه P) صرفاً در برابر اریترومایسین مقاوم بوده و در برابر کلیندامایسین حساس بوده اند.

۳ـ۳٫ مکانیزم های مقاومت

بررسی مکانیزم های ML در ارتباط با مقاومت بین ۲۵ جدایه مقاوم مشخص ساخته است که مقاومت عمدتاً در ارتباط با جهش های نقطه ای A2059G (13 جدایه، ۱۱ آکنه P، و دو P. granulosum) و A2058G (شش جدایه، پنج آکنه P و ۱ P. granulosum) می باشد، در حالی که جهش G2057A صرفاً در دو جدایه تشخیص داده شد (هر دو به عنوان آکنه P). در چهار جدایه مقاوم باقیمانده (سه P. avidum و ۱ P. granulosum) هیچگونه جهشی تشخیص داده نشد. ژن ermX نیز تشخیص داده نشده است. آنالیز آماری مشخص کننده تفاوت معنی دار آماری مکانیزم مقاومت ML می باشد که نتیجه آن (p=0.003) بین گونه ها است، اما هیچگونه ارتباط مشهودی در ارتباط با یک جهش خاص و سطح MIC یا فنوتیپ مقاومت تشخیص داده نشده است. کلیه سویه های مقاوم دارای MIC های بسیار بالا در برابر هر دوی آنتی بیوتیک های ML بوده (>256 mg/L)، به استثنای دو سویه با جهش G2057A که کاملاً در برابر اریترومایسین مقاوم بوده و مستعد خطر در برابر کلیندامایسین در نظر گرفته شده اند.

۳ـ۴٫ تیپ بندی MLST

MLST بر روی مجموع ۲۵ جدایه آکنه P انجام شد (۱۸ مورد مقاوم و ۷ مورد دارای آثار مجدد). در بین جدایه های مقاوم (جدول ۱) سویه ها یا اجداد نوع IA₁ (ST-1، ۳ و ۵۲) مشخص گردیده و مسئول ۱۲ مورد از ۱۸ جدایه تشخیص داده شدند (۷/۶۶%)، در حالی که تیپ بندی سویه IA₂ (ST-2 و ۲۲) مسئول پنج مورد بیشتر جدایه ها به شمار آمده اند (۸/۲۷%). در نهایت آخرین جدایه باقیمانده (ST-42) متعلق به تیپ بندی سویه IB می باشد.

تیپ بندی MLST جدایه های آکنه پروپیونیباکتریوم

۴- مباحث

داده های اندکی در ارتباط با پروفایل های خطرپذیری وجود داشته و به علاوه تیپ بندی مولکولیPropionibacterium spp.  نیز با توجه به بهبودی از آکنه ولگاریس در این زمینه مشخص گردیده است. مطالعه جاری اقدام به بررسی اکثریت بیماران ثبت نام نموده در این بررسی کرده و یک رشد مثبت آزمایشگاهی را در ارتباط با Propionibacterium spp. حاصل آورده است، که سازگار با مطالعات قبلی می باشد [۵، ۲۲، ۲۳]. با این وجود، ذکر این نکته ضروری است که در تقریباً کلیه مطالعات، بیمارانی با آکنه وجود دارند که کشت پروپیونی باکتریا آنها منفی گزارش شده است [۵، ۲۲، ۲۳]، که می توان آن را در ارتباط با درمان ضدمیکروبی قبلی یا کنونی دانست، یا آن را به صورت بیان بیش از اندازه دیگر پاتوژن ها در ارتباط با این عارضه به شمار آورد. به علاوه، پاتوژن آکنه به صورت چند فاکتوریل بوده و وجودPropionibacterium spp.  تنها به عنوان یکی از چندین عامل مدنظر می باشد.

تیپ بندی MLST جدایه های آکنه پروپیونیباکتریوم

 نتیجه گیری

لازم است تا این نکته ذکر شود که مطالعه ما نشان دهنده مقاومت آنتی بیوتیک در برابر پروپیونیباکتریوم SPP می باشد که به صورت انحصاری در برابر گروه ML از آنتی بیوتیک ها مشخص گردیده و در ارتباط با جهش های نقطه ای ۲۳S rRNA می باشد. به علاوه، جدایه های مقاوم ـ ML دارای قابلیت کلنی سازی بیشتری در مقایسه با انواع مستعد خطر می باشند. با این وجود، سویه های تکثیر شده متعلق به گونه های مختلف بوده یا دارای فنوتیپ های مقاومت مختلفی هستند که از این گروه بیماران منفک گردیده است، آن هم بدون کاربرد رسانه تکمیلی آنتی بیوتیک، بنابراین معرف نیاز برای بررسی ها و پیشرفتهای متعاقب راهکارهای کشت آزمایشگاهی و همچنین بررسی های بیشتر در خصوص اهمیت واقعی بالینی این جمعیت های دوبل می باشد.