اکتشاف ژن های مهارکننده تومور از طریق آنالیز تعداد کپی مقیاس ـ ژنوم

اکتشاف ژن های مهارکننده تومور از طریق آنالیز تعداد کپی مقیاس ـ ژنوم – ایران ترجمه – Irantarjomeh

مقالات ترجمه شده آماده گروه پزشکی

مقالات ترجمه شده آماده کل گروه های دانشگاهی

مقالات

اکتشاف ژن های مهارکننده تومور از طریق آنالیز تعداد کپی مقیاس ـ ژنوم

چکیده

فرآیند اکتشاف کلاسیک ژن مهارکننده تومور به میزان زیادی شامل آنالیز به هم پیوستگی ژنی و غربالگری از دست دادن هتروزیگوسیتی (LOH)، همراه با نگاشت جزئیات نواحی کرموزومی نسبتاً بزرگ می باشد. تلاشهای متعاقبی سعی در کاربرد روشهای PCR– مبنا در مقیاس ژنوم نموده تا قابلیت تشخیص پدیده نادر حذف های هوموزیگوت را داشته باشند. اخیراً، آرایه های ژنومی با وضوح بالا جهت اکتشاف ژن سرطانی به کار گرفته شده اند. با این وجود، توصیف دقیق نواحی مشکل آفرین در ارتباط با کاهش / از دست دادن ژنوم کاملاً چالش برانگیز خواهد بود که علت آن را می توان ناهمگنی نمونه، اندازه کوچک نواحی حذف شده و فراوانی بالای چند ریختی های تعداد کپی سلول زایا / ژرم لاین دانست. در اینجا، ما نسبت به بازنگری کاربرد تحلیل تعداد کپی مقیاس ـ ژنوم جهت مشخص سازی مشکل شناسایی ژن های مهارکننده تومور اقدام می نماییم.

کلمات کلیدی: آرایه CGH، تحلیل تعداد کپی، سرطان، ژن های مهارکننده تومور.

اکتشاف ژن های مهارکننده تومور از طریق آنالیز تعداد کپی مقیاس ـ ژنوم

مقدمه

از زمان نشان دادن اولیه این موضوع توسط Bishop و Varmus بیش از ۳۰ سال قبل، که آنکوژنهای تغییر شکل دهنده از ژن های سلولی طبیعی حاصل می شوند، کشف بیشتر جهش های خاص ـ سرطانی سبب ایجاد امیدواری در ارتباط با تشخیص و مداوای سرطان با استفاده از روندهای خاص توموری شده است {۱}. با این حال، با وجود آنکه شناسایی ضایعات حاصله ژنتیکی در ارتباط با سرطان ها سبب ارتقای فرایندهای تشخیصی و درمانی در برخی از موارد شده است، مجموع کل بیمارانی که از این رویکردها سود می جویند تقریباً کسر اندکی از کل بیمارانی که از سرطان رنج می برند را تشکیل می دهند {۲ ـ ۷}. به منظور مشخص نمودن ژن های بیشتر سرطانی، تعدادی از رویکردهای غیرسودار، در مقیاس ژنوم پدیدار شده اند که قابلیت تشخیص کسر بزرگی از تفاوت های ژنتیکی بین تومورهای انسانی و بافت های طبیعی انسان ها را خواهند داشت. در بین این موارد، ایجاد فناوریهای هیبریداسیون ژنومیکی آرایه مبنا سبب هموارسازی راه برای بررسی تعداد فزاینده ای از آزمایشات برای آن دسته از نشانگرهایی شده است که در ارتباط با ژنوم سرطانی گسترش یافته و با توجه به افزایش و کاهش شدت، که مشخص کننده تغییرات جسمی است، می توان آن را در ارتباط با تشکیل تومور دانست. جهت تسهیل چنین آنالیزی، مجموعه بزرگی از اطلاعات حاصله از روشهای مختلف، همراه با رویکردهای اتوماتیک به منظور پالایش سیستماتیک تعداد ژن های سرطانی کاندید برای مشخص سازی متعاقب ویژگی های ژنتیکی و کاربردی آنها ارائه شده اند. چنین امری منجر به مشخص سازی تعداد زیادی از کاندیدهایی شده است که اهمیت بیولوژیکی آنها را می بایست تحت فرایند تحلیل ژنتیکی عمیق تری درک نمود تا قابلیت اعتبارسنجی استوار و کارکرد مناسب آنها فراهم شود. در اینجا، ما کاربرد آنالیز تعداد کپی ژن آرایه مبنا جهت مشکلات خاص مشخص سازی ژنهای مهارکننده تومور را مد نظر قرار می دهیم. ما کار خود را از طریق بررسی اکتشاف ژن های مهارکننده تومور برای موضوعات شایعی آغاز می نماییم که می توانند به ما در زمینه تفسیر کاندیدهای مشخص شده از طریق رویکردهای ژنومی کمک نمایند. متعاقباً، ما رویه ایجاد رویکردهای مرتبط با مقیاس ژنوم را مورد بررسی قرار می دهیم که هدف از آن شناسایی کلی تغییرات تعداد کپی در سرطان می باشد. متعاقباً ما بر روی آنالیز تعداد کپی آرایه مبنا تمرکز نموده و مراحل اصلی تبدیل برآوردهای شدت سطح آزمایشی در نواحی حذف شده را مورد بررسی قرار می دهیم که دربردارنده ژن های مهارکننده تومور نیز هستند. در نهایت، ما مثال های خاص کاندید جدید مرتبط با ژن های مهارکننده تومور که از طریق آنالیز تعداد کپی مقیاس ژنوم مشخص شده است را مورد بررسی قرار داده و شواهد مرتبط با شامل بودن آنها در سرطان انسان را خلاصه می نماییم.

اکتشاف ژن های مهارکننده تومور از طریق آنالیز تعداد کپی مقیاس ـ ژنوم

اکتشاف ژن های واجد شرایط مهارکننده تومور

از نقطه نظر تاریخی رویکردهای ژنتیکی برای اکتشاف ژن های مهارکننده تومور (TSGs) نیازمند نوعی اعتبارسنجی چندین ژن کاندید می باشند که در داخل یک ناحیه کرموزومی بزرگ وجود داشته و در ارتباط با آنالیز به هم پیوستگی در خانواده هایی هستند که با سندرم سابقه وقوع سرطان یا پدیده از دست دادن آللی خاص تومور (که همچنین تحت عنوان کاهش هتروزیگوسیتی/ LOH نیز خوانده می شود) روبرو می باشند. چندین مورد قابل توجه از این تلاشها بشرح ذیل حاصل آمده اند (جدول ۱).

۱- آموزندگی موارد نادر در ارتباط با حذف های کانونی (هموزیگوس)

در دوران “پیش ـ ژنومی”، نواحی کرموزومی که بر مبنای آنالیز به هم پیوستگی یا غربالهای LOH دلالت بر سرطان داشتند غالباً (برحسب مرتبه چندین مگاباز) بسیار بزرگ بوده و بنابراین به طور طبیعی نیازمند مراحل تکراری ژنوتیپینگ با نشانگرهای ژنتیکی بسیار بوده و سرانجام می بایست فرآیند توالی سازی بسیاری از ژن های کاندید جهت تشخیص جهش های غیرفعال که معرف TSG هدف می باشند انجام گردد. در غالب موارد، مشخص سازی ژن هدف متکی به اکتشاف موارد نادری می باشد، آن هم با توجه به حذف های کانونی (حذف های هتروزیگوس ژرم لاین برای آن دسته از ژن هایی که مستعد سرطان بوده و حذف های هموزیگوس خاص ـ توموری بدنی برای تومورهای پراکنده) که  شامل  یک  یا  چندین  ژن  می باشد (جدول ۱). در حقیقت، شناسایی مقدار حذف های هموزیگوس کانونی خاص تومور جهت مشخص سازی TSGهای جدید سبب ایجاد انگیزه لازم برای ایجاد رویکردهای غیرسودار و در مقیاس ژنوم برای تشخیص آنها  شده است (به مبحث ذیل رجوع شود){۸ ـ ۱۱}.

اکتشاف ژن های مهارکننده تومور از طریق آنالیز تعداد کپی مقیاس ـ ژنوم

۲- حذف های بسیار کوچک و قابلیت غیرفعال سازی ژن ها

از نقطه نظر تئوری، حذف یک نوکلئوتید کدکننده تکی سبب جهش تغییر دهنده چارچوب کد ژنتیک می گردد که متعاقبا خود منجر به عدم فعال شدگی ژن از طریق نقص پروتئین خواهد شد. با وجود آنکه تشخیص حذف های نوکلئوتید تکی به صورت الزامی نیازمند تعیین توالی نوکلئوتید واحد می باشد، حذف های بسیار کوچکی که با یک یا چند ژن روبرو می گردند به عنوان ابزارهای مهم در کلنی سازی بسیاری از TSGهای مهم تلقی خواهند شد (جدول ۱) {۱۲ ـ ۲۲}. مشخص سازی ژن APC منوط به آنالیز دو مورد با حذف های کانونی می باشد که دقیقاً سه ژن را شامل می شود {۱۴ ، ۱۶}. حذف های هموزیگوس کانونی در خطوط سلول سرطان را می توان به عنوان ابزاری جهت تعیین INK4A/B به عنوان یکی از شایع ترین هدف های غیرفعال سازی ژنتیکی در سرطان های انسانی به کار گرفت {۱۷ ، ۲۲}. از دست دادن هیدروزیگوسیتی تقریباً بر روی کل شاخه بلند کرموزوم ۱۰ تأثیرگذار بوده که کاملاً در غدد مغزی اولیه شایع می باشد، و شناسایی PTEN نیز از طریق اکتشاف خطوط سلولی نادر با حذف های هموزیگوس داخل ژنی که بر روی PTEN تأثیر گذاشته ولی بر روی دیگر ژن های مجاور بی تأثیر خواهد بود حاصل می شود {۱۱ ، ۲۰}. حذف دقیقاً ۲۵ نوکلئوتید (در یک طیف مرز اگزون ـ اینترون و حصول یک پیوند غیرمعمول) به عنوان یک مؤلفه حیاتی در خصوص شامل نمودن یا دلالت دادن WT1 در تومور ویلمز محسوب می شود {۱۲ ، ۱۵}. همانگونه که از شکل ۱ مشاهده می شود، یک اسکن با وضوح بالای موقعیت ژنومی که مناطق حذف هموزیگوس را هدف قرار می دهد مشخص کننده حذف های گسترده همراه با دربردارندگی چندین ژن و حذف های کاملاً کانونی و بین ژنی می باشد که سبب از هم گسیختگی یک یا چند اگزون کدکننده شده و بنابراین به طور مستقیم بر ژن واحد و مورد هدف دلالت خواهد داشت.

اکتشاف ژن های مهارکننده تومور از طریق آنالیز تعداد کپی مقیاس ـ ژنوم

۳- تشخیص حذف های هموزیگوس به صورت کاملاً حساس در برابر تأثیرات سابقه و ترکیب استروما

هر کدام از مثال های توصیف شده فوق منوط به وجود حذف در هر سلول در داخل نمونه های تحت تحلیل می باشد، چه به واسطه آنکه حذف در ژرم لاین وجود دارد (همانند زمینه سرطان TSG) {12 ، ۱۴ ـ۱۷} یا به واسطه آنکه خطوط سلولی سرطان یا کشت های اولیه (به صورت محتمل، حاصل آمده از کلنی) (برای TSGهای غیرفعال بدنی) بکار گرفته شده باشند {۱۷ ، ۲۰}. برای هر دوی رویکردهای مبتنی بر ـ PCR و، همانگونه که ذیلاً توصیف می شود، تحلیل های تعداد کپی آرایه ـ مبنا، تشخیص این حذف ها را میتوان علی الخصوص مقید به وجود استرومای مرتبط با تومور به صورت ترکیبی دانست، چرا که وجود ژنوم های دیپلوئید غیرسرطانی ممکن است منجر به تشخیص ترجیحی موارد غیرحذف شده، DNA نرمال، شود {۸، ۲۳}. به علاوه، اندازه گیری درست موارد از دست رفته ژنومی از نقطه نظر ذاتی بسیار مشکل تر است از تشخیص موارد تکثیری آن می باشد، چرا که این کاهش ها تنها محدود به یک یا دو کپی می باشند، و هر گونه سیگنال باقیمانده کاملاً نزدیک به محدوده های پایینی تشخیص پلتفرمی می باشد که تحت استفاده قرار گرفته است.

مشخص نمودن ژن های مهارکننده تومور به وسیله آنالیز تعداد کپی مقیاس ژنومی

رویکردهای PCR مبنا

در تلاش های غیرسوگیرانه اولیه، جهت غربال ژنوم سرطان برای نواحی کاهش ژنومی، که به طور بالقوه سبب بروز ژن های مهارکننده تومور می شوند، از PCR جهت غنی سازی توالی های DNA که در DNA ژنومی طبیعی وجود دارند، و در DNA توموری دیده نمی شوند، استفاده شد. در بین روش های متعددی که جهت شناسایی تفاوت های بین ژنوم های پیچیده به کار گرفته شده اند، آنالیز بازنمایی تمایز (RDA) به صورت موفقی جهت شناسایی TSGهای نوین به کار گرفته شد {۸ ، ۹}. روش RDA متشکل از آنزیم های محدودکننده گوارش هیبریداسیون کاهنده و تکثیر PCR انتخابی جهت ایجاد نوعی شاخص های ساده شده ژنوم با استفاده از تومور ترکیبی و نمونه های نرمال تطبیقی می باشد. RDA کاملاً برای تشخیص تفاوت های نادر در ژنوم های یکسان بزرگ توانمند می باشد ( همانند توالی های ویروسی، نمونه های تومور با قابلیت دسترسی DNA طبیعی تطبیقی). RDA به عنوان یک ابزار در فرایند کلنی سازی PTEN، BRCA2 و دیگر ژن های مهارکننده تومور کاندید مدنظر خواهد بود {۱۸ ، ۲۴ ، ۲۵}. با این وجود، چندین خصیصه سبب پیچیده شدن کاربرد آن به عنوان یک ابزار غربالگری شناسایی ژن سرطان شده است: (۱) پیچیدگی فنی (که سبب محدود شدن تعداد نمونه هایی می شود که قابلیت آنالیز آنها وجود دارد)، (۲) عدم ثبات ژنومی در تومورهای توپر، که منجر به تشخیص نواحی کاندید بسیاری خواهد شد که به نظر در DNA توموری (در مقایسه با مورد معمولی) کاهش یافته اند، (۳) پولیمرفیزم یا چندریختی تعداد کپی، که در غیاب DNA بافت طبیعی تطبیقی، منجر به ایجاد مثبت های کاذب بسیاری شده و (۴) این حقیقت که نواحی کاندید به صورت دفعتاً شناسایی شده و می بایست از حالت پیچشی خارج شده تا قابلیت اعتبار سنجی لوکای یا موقعیت آن مشخص شود. با این وجود، پیشرفت های متعددی جهت افزایش توان RDA به وجود آمده اند. با استفاده از DNA ژنومی تومور از مدلهای موش مهندسی شده ژنتیکی و DNA نرمال تطبیق داده شده ـ سویه قابلیت کاهش تأثیر گوناگونی تعداد کپی ژرم لاین وجود خواهد داشت، در عین حال با ترکیب مراحل اولیه با توجه به هیبریداسیون آرایه مبنا قابلیت مشخص سازی ترکیبات پیچیده لوکای های تکثیر شده متفاوت حاصل خواهد شد (با استفاده از آنالیز آرایه الیگونوکلئوتید/ ROMA ـ به موارد ذیل رجوع شود) {۲۵ ، ۲۶}.

مقایسه میکروآرایه مبنای هیبریداسیون ژنومیک (CGH)

تظاهر اولیه عدم تعادل ژنومیک خاص تومور به وسیله کاریوتیپینگ یا مجموعه خصوصیات کرموزومی موجودات و متاستاز سنتی سبب ایجاد روش های کاملاً حساس برای تشخیص نارسائیهای سیتوژنتیکی در سرطان شده است. با توجه به هیبریداسیون ژنومی مقایسه ای (CGH)، تومور دارای برچسب فلئورفور (همانند فلئورسئین) و DNA طبیعی (همانند ردامین) به صورت متاستاز طبیعی کوهیبرید شده تا قابلیت انتشار در حضور Cot-1 DNA بدون برچسب (بلوکه سازی پیوند هدف برای توالی های تکراری) را داشته باشد، و از این طریق اجازه تشخیص کمی نواحی گسسته افزایش کرموزومی یا کاهش آن (همانگونه که به وسیله نسبت فلرسین به ردامین ـ فلرسنز) نشان داده شده است را داشته باشد {۲۷}. CGH اجازه کاتالوگ نمودن تومورهای انسانی بر مبنای نواحی عود کننده که دارای همبستگی با ویژگیهای بالینی را دارد را می دهد و بر این مبنا قابلیت مشخص سازی ژن های سرطانی سببی را به وجود خواهد آورد {۲۸}. با این وجود، استفاده کرموزوم های متاستاز جهت موضعی سازی تغییرات ژنومی و پیچیدگی بالای آزمایشات مربوط بدان سبب محدودشدگی وضوح تشخیص تا تقریباً ۲۰ Mb می گردد. یک روش مرتبط، کاریوتایپینگ طیفی (SKY) قابلیت ترکیب فلورسنس دارای رنگهای متعدد برای هیبریداسیون محلی با توجه به آنالیز طیفی را خواهد داد که خود علی الخصوص برای تشخیص جابجایی های کرموزومی مهم تلقی می شود، با این حال وضوح آن همچنان محدود است (۱ ـ ۲ Mb) {28}.

تبدیل سیگنال های ـ پروب به تعداد کپی ژنومیک

با وجود آنکه از نقطه نظر تئوریکی تعداد کپی در هر موقعیت ژنتیکی را می بایست بر مبنای مقادیر صحیح آن محاسبه نمود (همانند کاهش تک کپی، حذف یا افرایش هموزیگوس)، مقادیر سطح متوسط غالباً در آنالیزهای آرایه مشاهده می شوند. منابع “نویزدار” برآوردهای تعداد کپی شامل چند ریختی های موجود در DNA آرایه ای، تنوع پذیری خاص ـ توالی پروب در سنتیک های هیبریداسیون، موقعیت های پروب نگاشت شده  نادرست و ترکیب  استروما می باشند. تعداد متنوعی از روشهای محاسباتی جهت مشخص نمودن اتوماتیک نواحی ژنومی دستاوردهای حاصله از داده های سطح پروب ایجاد شده اند {۲۶ ، ۳۹ ـ ۴۹}. با وجود تفاوت های ریاضیاتی در بین روشهای فردی، رویکردهای کلی عبارتند از: (۱) نمونه به نمونه و کرموزوم به کرموزوم، ترکیب داده ها از نشانگرهای مجاور با تعداد یکسان کپی، (۲) مشخص سازی گذارهای معنی دار آماری در تعداد کپی از پروب های مجاور با استفاده از یک توزیع مرجع از هیبریداسیون های بافت طبیعی یا از طریق تست ویژگی های تغییر یافته یا جای گشت، و (۳) تکرار ویژگی ها تا زمانی که اهمیت برای هر مورد از گذارهای تعداد کپی به حداکثر برسد، که سبب ایجاد بخش های ژنومی شده که خود متشکل از تعداد متغیری از پروب های متصل می باشند که دارای تعداد کپی مشابه آماری خواهند بود. الگوریتم های جداسازی برای ساده سازی مجموعه های بزرگ اطلاعاتی حاوی نمونه های بسیار به تعداد قابل مدیریت جایگزینی های گسسته برای آنالیز متعاقب ضروری خواهد بود. با این وجود، جهت مشخص سازی ژن های مهارکننده تومور، لازم است تا این موضوع را در نظر بگیریم که چگونه هر الگوریتم قابلیت به کارگیری دو ویژگی متنوع در داده های سطح ـ پروب، با توجه به یکنواخت سازی و بخش های کوچک، را خواهد داشت.

امتیازدهی یک ناحیه تغییریافته به عنوان مورد حذف شده

نمره دهی / امتیازدهی موارد کاهش ها یا از دست رفته نیازمند یک بررسی دقیق در خصوص میزان دگرگونی و تغییرات حاصله می باشد. غالب رویکردها آستانه های تعداد کپی ثابت از قبل مشخص شده، چه به صورت تجربی و چه بر مبنای توزیع شدت های پروب در نمونه های مرجع، را مدنظر قرار میدهند. پروب ها یا بخش هایی که دارای تعداد کپی خارج از چنین آستانه ای هستند به عنوان موارد دارای دگرگونی معنی دار تلقی می شوند {۵۴،۵۲،۵۱}. برخی از محققین اقدام به بکارگیری آستانه های متعدد جهت مشخص نمودن افزایش های سطح پایین از تکثیرهای سطح بالا و کاهش کپی تکی از حذف های هوموزیگوس نموده اند {۵۰،۳۵}.

ارزیابی نرخ سابقه انحراف

تلاش های اولیه جهت تعریف نواحی ژنومیک جایگزین شده که به طور بالقوه قابلیت پرورش ژن های سرطانی جدید را دارند، یعنی نواحی دارای اولویت با تغییر نرخ عود – مواردی که در بیش از یک نمونه تشخیص داده شده اند، انجام شد {۶۰،۴۰،۲۳}. با این وجود، وابستگی بر نرخ های اصلی جهش و تعداد نمونه های آنالیز شده، حتی دگرگونی های عودکننده ممکن است به عنوان محصولات جانبی عدم ثبات ژنوم توموری در مقایسه با بی نظمی های پیش برنده حقیقی به شمار آید. بنابراین، به هنگام مشخص سازی نرخ اصلی جهش های نقطه ای در مطالعات توالی یابی مجدد ژنوم تومور، تحلیل های تعداد کپی اخیرتری سعی در ارزیابی نرخ سابقه جهش به عنوان مبنایی برای تعیین اهمیت آماری نموده اند. ارزیابی نرخ جهش های نقطه ای غالباً از طریق مشخص سازی نرخ جهش های خاموش در داخل توالی های کدکننده و / یا جهش های نقطه ای در نواحی حاوی غیر ژن ژنوم (چنین مواردی از نقطه نظر فنوتیپیک به صورت خنثی تلقی شده و بنابراین قابلیت عمل بر مبنای انتخاب را نخواهند داشت) حاصل شده است {۶۱-۶۵}.

توجه به میزان تغییر تعداد کپی

برخی از رویکردها میزان تغییر (چه مقدار از کپی های یک ژن اضافه یا کاهش می یابند) را در خصوص تعیین اهمیت (همانند فراوانی تغییرات مشاهده شده) مدنظر قرار می دهند. رویکرد کلی وظیفه مشخص سازی آستانه های بسیار پایین برای امتیازدهی اولیه موارد کاهش یافته یا افزایشی و پس از آن وزن کشی هر مورد تغییر یافته از طریق میزان حقیقی آن را بعهده خواهد داشت. این نوع وزن کشی را می توان با استفاده از یک مقیاس پیوسته یا کلاسهای گسسته مرتبط انجام داد (همانند میزان افزایش تک کپی، میزان کاهش تک کپی، میزان تکثیر، یا میزان حذف هوموزیگوس) {۳۸ ، ۵۰ ، ۵۱}. برای تکثیرها، چنین موردی ممکن است مفید باشد. با این حال، محدوده دینامیکی میزان افزایش از یک کپی تا بیش از ۳۰ کپی اجتمال خواهد داشت و به طور کلی، میزان تکثیر دارای همبستگی با بیان بیش از حد در سطح پروتئین می باشد (و بنابراین وابسته به میزان فعال سازی ژن هدف خواهد بود). با این وجود، برای حذف ها، دو دامنه وجود دارد: از حذف یک یا دو کپی (آن چیزی که تحت عنوان معنی حقیقی مقادیر تعداد کپی غیرصحیح مشاهده شده و علاوه چگونگی وزن کشی آنها به شمار می آید). بنابراین، منوط به تعامل نسبی فراوانی تغییر در برابر دامنه آن با توجه به نمرات کلی، اهمیت حقیقی میزان از کاهش ژنومی خاص می بایست به میزان کمتر یا بیشتر مورد ارزیابی قرار گرفته باشد.

یافتن ژن های واحد هدف گیری شده بوسیله یک حذف

با وجود آنکه اعتبار سنجی ژن های کاندید که به وسیله حذف های کاملاً کانونی  هدف قرار می گیرند نسبتاً سرراست می باشند، تعیین اولویت بسیاری از ژن های کاندید که تحت یک حذف بزرگ منفرد قرار دارند چالش برانگیزتر می باشد. تمرکز بر روی ناحیه مشترک حداقلی (MCR) که به وسیله حذف های همپوشان هدف قرار گرفته است ممکن است سبب کم شدن تعداد ژن های کاندید گردیده و بنابراین آنالیز بیان ژن به صورت موازی قابلیت شناسایی مجموعه فرعی ژن هایی را خواهد داشت که در داخل یک ناحیه حذف شده در سطوح پایین تر بیان می شوند {۵۰}. به علاوه، انتخاب زیرمجموعه پروب ها در داخل یک MCR با بیشترین (یا معنی دارترین) دامنه بی نظمی در تعداد کپی جهت کاهش متعاقب لیست کاندید به کار گرفته شده است {۵۱}. با این وجود، این عمل نیازمند آن خواهد بود که آن دسته از پروب هایی که بر روی ژن هدف قرار گرفته اند نیز به عنوان بیشترین موارد بی نظمی تلقی گردیده، فرضی که به وسیله بررسی ویژگی های نشان های پروب در ژن های مهارکننده تومور خود سبب ایجاد نوعی چالش می شود {۳۸}. یک رویکرد جدید در زمینه تعیین این موضوع، که آیا یک تغییر بزرگ می تواند سبب شود تا بیش از یک هدف قابلیت حذف بیشترین مجموعه بی نظم (معنی دار) پروب های پیوسته را داشته باشد و قابلیت محاسبه مجدد اهمیت پروب های باقیمانده را دارد یا خیر، و همچنین می تواند نسبت به تعیین این موضوع اقدام کند که آیا هر زیرمجموعه دیگر پروب های پیوسته همچنان در حالت معنی دار می مانند یا خیر، مدنظر خواهد بود {۵۱ ، ۵۲}.

ژن های مهارکننده تومور کاندید جدید مشخص شده به وسیله آنالیز تعداد کپی

با بررسی مراحل اصلی شامل شده در خصوص کاهش یا تقلیل هزاران مورد از شدت های پروب برای یک تعداد قابل مدیریتی از ژن های مهارکننده تومور کاندید، ما هم اکنون اقدام به بحث پیرامون مثال های کاندیدهای خاص ژن های مهارکننده تومور می نماییم که بر مبنای تحلیل های تعداد کپی مقیاس بزرگ یا آرایه مبنا مشخص شده اند. با وجود آنکه لیست ژن های کاندید مورد بررسی به هیچ عنوان جامع نمی باشد، هدف اولیه ما نشان دادن این موضوع خواهد بود که چگونه هر کاندید انتخاب گردیده و به صورت حیاتی قابلیت ارزیابی داده های حاصله متعاقب از مطالعات عمیق تر ژنتیکی و ارزیابی های کاربردی، که خود تأیید کننده ویژگی های کارکرد مهارکنندگی تومور برای هر کاندید است، را خواهد داشت.

اکتشاف ژن های مهارکننده تومور از طریق آنالیز تعداد کپی مقیاس ـ ژنوم

ژن های مهارکننده تومور غده مغزی / گلیوما جدید: PARK2  و PTPRD

یک رویکرد جامع جهت تبدیل داده های شدت سطح پروب به نواحی کاندید سرطانی و ژن های مرتبط به منظور مشخص سازی ژنوم های چندین سرطان شامل غدد مغزی یا گلیوماها، آدونوکارسینوم شش و کارسینوم های سلول کلیوی مورد بررسی قرار گرفته است { ۵۱ ،۵۲ ،۵۴ ،۷۰}. این رویکرد، که تحت عنوان شناسایی ژنومی اهداف معنی دار در سرطان یا GISTIC شناخته می شود، نشان دهنده مراحل بسیاری از رویه های تحلیلی مشخص شده در بخش اول این مطالعه می باشد. در ابتدا، یکسری از مراحل پردازش اطلاعات تبدیل های ـ log2 و مراکز میانه داده های شدت پروب (نمونه به نمونه) اصلاح شده برای مشخص سازی گوناگونی های سیستماتیکی در شدت های پروب که در مجموعه های فرعی آرایه ها (تأثیرات دسته ای) مشخص می باشند، قابلیت تبدیل شدت پروب به تعداد کپی از طریق به هنجارسازی هر نمونه تومور تنها به مجموعه فرعی (غیرتطبیقی) نمونه های نرمال با رفتار جامع پروب مشابه (به هنجارسازی تانژانت)، و حذف نمونه های نسخه برداری و نمونه هایی که به وسیله ترکیب استروما معنی دار آلوده شده است را خواهد داشت. متعاقباً، داده های تعداد کپی سطح ـ پروب بخش بندی شده (با الگوریتم بخش بندی GLAD) و هر بخش یکنواخت سازی گردیده و میزان میانه آن تعیین می گردد (بدان معنا که هر پروب به یک مقدار تعداد جدید کپی مساوی با مقدار میانه برای کلیه پروب ها که در  همان  بخش  وجود  دارند  تخصیص  داده می شود) {۴۲}. سوماً، نواحی چندریختی همپوشانی پروب ها همانگونه که در بانک اطلاعات گونه های ژنومی مشخص شده اند حذف می گردند {۵۵}. چهارماً، هر پروب به وسیله نمره ـ G امتیازدهی می شود، و برای این کار از محصول فراوانی بی نظمی و میانگین دامنه هر یک از نمونه ها استفاده شده و از طریق مقایسه نمره ـ G واحد اهمیت آن برای موارد حاصله به صورت تقریبی از کل توزیع خنثی مشخص گردیده و مقادیر ـ p حاصله برای مقایسات متعدد اصلاح می شوند تا قابلیت ایجاد مقادیر ـ q به وجود آید. پروب های دارای مقادیر ـ q <0.25 به نظر معنی دار می باشند. در نهایت، ژن های کاندید از مجموعه فرعی پروب ها که دارای کمترین مقدار ـ q در هر ناحیه هستند مشخص می گردند.

اولین ژن های مهارکننده تومور کرموزوم X: WTX و UTX

اکتشاف WTX نشان دهنده توان آنالیز تعداد کپی مقیاس ژنومی به هنگام تمرکز بر روی مجموعه محدودی از تومورهای کاملاً مرتبط با یک نرخ سابقه پایین تغییرات ژنومی می باشد {۱۹}. تومور ویلمز به عنوان شایع ترین سرطان کلیه در اطفال به شمار می آید. غیرفعال شدگی ژنتیکی  هتروزیگوس ژرملاین عامل رونویسی انگشته روی دار WT1 مسئول دو شکل تومور ویلمز خانوادگی به شمار می آید (آلل ثانویه در تومورها غیرفعال است)، و غیرفعال شدگی دو آللی سماتیک در ۵ الی ۱۰% از تومورهای ویلمز به صورت پراکنده دیده شده است {۱۲ ، ۱۵ ، ۱۹}. به علاوه، فعالسازی جهش ها در ژن CTNBB1 و بی نظمی اپی ژنتیک محور IGF در موارد نادری تشریح شده است {۸۰}. با این وجود، در اکثریت موارد، هیچگونه نارسائی ژنتیکی خاصی مشخص نشده است.

سرطان خون / لوسمی لنفوبلاستی حاد (ALL) و PAX5

 همانند WTX، اکتشاف جهشهای غیرفعال در PAX5 و دیگر ژن های تعیین B – لیمفوسیت، در ALL اطفال،  نشان دهنده توان تحلیل تعداد کپی برای ژن های مهارکننده تومور حیاتی مشخص می باشد، مخصوصاً به هنگامی که بر روی نوع واحدی از سرطان با یک نرخ سابقه تقریباً  اندک دگرگونی های تعداد کپی تمرکز شود {۸۲،۸۳}. در تضاد با تومور ویلمز، آسیب های ژنتیکی آغاز شده به واسطه تومور در بسیاری از ALLهای کودکان تعریف شده اند، شامل جابجایی های کروموزومی (همانند TEL-AML1، E2A-PBX1، BCRABL، E2A-PBX1) و آرایش مجدد آن ها شامل MLL {84}. با این وجود، هیچ کدام از این آسیب ها سبب بروز فنوتیپ لوسیمی کامل در مدل های حیوانی نشده است، که خود موکد نیاز برای اعمال تغییرات مشارکتی بیشتری می باشد. جهت جستجو برای چنین تغییرات ژنومی، Mullighan و همکاران اقدام به بررسی بلاست های لوسیمی خالص از ۲۴۲ مورد ALL اطفال با استفاده از آرایه های SNP با وضوح بالا نمودند. تعداد کپی در یک حالت نوین از طریق به هنجار سازی هر پروب جهت تشدید پروب های حاصله از نواحی دیپلویید شناخته شده در داخل ژنوم نمونه های مشابه (همانگونه که به وسیله سیتوژنتیک مشخص شده است) قبل از بخش شدگی تعیین گردید. این بخش شدگی ها متشکل از کمتر از ۳ SNPها به صورت فیلتر شده بوده و بقیه بخش ها که حاوی یک میانگین log2 نسبت تعداد کپی ³ ۰٫۲ یا £ -۰٫۲ بوده اند به عنوان موارد افزایشی یا کاهشی امتیازبندی شدند. گونه های تعداد کپی ژرم لاین برای ۲۲۸ نمونه از طریق نمونه فروکش جفتی موجود به عنوان مرجع تعداد کپی حذف گردیده و برای ۱۴ نمونه غیر تطبیقی نیز از طریق حذف پروب هایی که به صورت چند ریختی در بانک اصلی  نمونه های مرجع بود اقدام شد.

نتیجه گیری

در هیچ کدام از رشته های دیگر بیولوژی یا پزشکی گستره مطالعاتی در ارتباط با رویکرد های مقیاس ژنوم، به عنوان علم ژنتیک سرطان انسانی، تا این اندازه وسیع نبوده است. یک مجموعه غیر منتظره داده ها تشریح کننده وجود بی نظمی ها در تعداد کپی تومور انسانی می باشد که در خلال سالین اخیر برحسب شناسایی بسیاری از نواحی عود کننده دارای ویژگی های افزایشی یا کاهشی بوده که خود بعنوان عاملی بحساب می آید که ممکن است سبب بروز ژن سرطانی شود. این مطالعات بر روی تعداد متنوعی از پلتفرم های آرایه ای با استفاده از گوناگونی الگوریتم های مورد استفاده، جهت مشخص سازی نواحی ژنومیک، آستانه های مختلف افرایشی و کاهشی با توجه به مشخص نمودن نمره یا رتبه آنها، یا معیارهای مختلف اولویت بندی ژن های کاندید و تعیین اهمیت آماری، انجام شده اند. همانگونه که بحث شده است، با توجه به چالش های خاص مرتبط با تشخیص موارد از دست رفته یا کاهش های ژنومیکی (در مقایسه با موارد افزایشی آن)، تشخیص صحیح تک-کپی و حذف های هوموزیگوس ممکن است منوط به فرضیه های خاص و روش های مشخص رویکردهای منحصربفردی باشند. بنابراین، اطلاع از این موضوع که چگونه هر یک از روش ها قابلیت مدیریت خاص در ارتباط با تشخیص این موارد را دارند، می تواند به ما در زمینه انتخاب کاندیدهای مناسب برای اعتبار سنجی متعاقب با بهره گیره از لیست های بزرگی از ژن ها کمک نماید.

به هنگام ارزیابی شواهد پشتیبان مربوط به نقش مهارکننده تومور برای یک ژن کاندید مشخص شده از طریق آنالیز تعداد کپی آرایه مبنا، چندین سوال اساسی را می بایست مدنظر قرار داد. کدام یک از پلتفرم های آرایه ای را می بایست مورد استفاده قرار داد؟ چگالی پروب ها تا چه میزان است؟ طبیعت یا ذات نمونه های مرجع استفاده شده جهت تعیین تعداد کپی چگونه است؟ در صورت کاربرد فرآیند جداسازی یا تفکیک، چگونه هر بخش کوچک را می بایست مدنظر قرار داد؟ کدام یک از انواع آستانه ها را می بایست جهت انتخاب موارد از دست رفته به کار گرفت؟ آیا گونه های مختلف تعداد کپی ژرم لاین را می بایست مد نظر قرار داد؟ آیا نرخ سابقه مرتبط با این کاهش ها را می بایست ارزیابی نمود (و چگونه)؟ آیا ژن های کاندید خاص قابلیت اعتبارسنجی با آنالیز عمیق تر و ارزیابی های کاربردی را دارند؟ آیا جهش ها (حذفها، جهش های نقطه ای) سبب تخریب هر دوی آلل ها می شوند؟ در صورتی که این امر صحت ندارد، آیا آلل نوع وحشی بیان می شود؟

حجم برشی داده های ژنومیک سرطان به عنوان فناوری های جدید در حال افزایش می باشد، به گونه ای که توالی یابی مجدد ژنوم کلی سرطان و آنالیز مقیاس ژنوم اصلاحات DNA اپی ژنتیک بگونه ای پالایش یابند که بتوان از آنها در کاربردهای زیادی استفاده نمود. بررسی آنالیز تعداد کپی آرایه مبنا به طور امیدوارانه ای سبب آرایه چارچوبی برای ارزیابی تعداد زیادی از ژن های مهارکننده تومور کاندید شده است که خود نوید دهنده ظهور پیشرفت های حاصله از این فناوری ها در آینده ای نزدیک می باشد.